第一部分氢气干预肺癌细胞的蛋白质组学分析目的:探究氢气干预对肺癌细胞A549蛋白表达水平的影响,以探究氢气抑制肺癌进展的相关机制。方法:将A549细胞分为2组,对照组和60%氢气组,每组设置三个重复实验。氢气处理72 h后收集蛋白,对两组A549细胞中提取的蛋白进行非标记定量蛋白组测序确定2组差异表达蛋白,随后对照这些差异蛋白进行基因本体(Gene Ontology)、KEGG pathway和蛋白-蛋白相互作用(Protein-protein interaction)分析。此外,选取肺癌A549和H1975细胞,均分为对照组和60%氢气处理组,分别应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(Real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,q RT-PCR)和蛋白免疫印迹技术(western blotting)检测2组细胞中CD47 m RNA和蛋白的相对表达水平。结果:1.较对照组相比,氢气处理可造成58个蛋白表达差异,其中包含35个上调蛋白,23个下调蛋白;2.58个差异表达的蛋白功能主要富集在“ribonucleoprotein complex biogenesis(核糖核蛋白复杂生物起源)”、“regulation of muscle system process(肌肉调节)”和“regulation of hypoxia-induced intrinsic apoptotic signaling pathway(调控缺氧诱导的凋亡通路)”、“ion channel binding(离子通道绑定)”、“U6 sn RNA binding”和“calcium channel inhibitor activity(钙通道抑制剂活性)”、“MICOS complex”和“myofibril(肌原纤维)”条目;3.氢气处理能显著下调CD47蛋白和m RNA的表达,这可能是氢气抑制肺癌进展的可能途径。小结:氢气处理可诱导肺癌细胞中58个蛋白差异表达,其中包含CD47,且经western blotting和q RT-PCR验证。此结果表明CD47可能是氢气抑制肺癌进展的一种途径。第二部分氢气通过调控CD47/CDC42通路抑制肺癌细胞生长、转移、侵袭及免疫逃避目的:通过体外细胞实验探究CD47/CDC42是否参与了氢气诱导的肺癌进展抑制。方法:肺癌A549和H1975两株细胞被用作此部分实验;采用细胞瞬时转染的手段上调或下调细胞中CD47的表达水平;氢气/CD47对肺癌细胞增殖、转移、侵袭和凋亡的影响分别通过CCK-8、划痕实验、Transwell小室侵袭实验和流式细胞术检测;western blotting实验用来检测细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2、caspase3、cleaved caspase3、PARP、cleaved PARP及CD47和CDC42蛋白表达水平的影响;体外巨噬细胞吞噬实验用来评估氢气对巨噬细胞吞噬作用的影响。
结果:1.氢气干预可明显抑制肺癌细胞增殖、转移和侵袭能力,并诱导细胞凋亡;2.CD47敲除可协同氢气处理共同抑制肺癌细胞增殖、转移和侵袭能力,并诱导细胞凋亡;3.CD47过表达可显著削弱氢气的抗肿瘤作用;4.氢气干预可增强巨噬细胞对肺癌细胞的吞噬作用。小结:氢气干预可通过下调CD47的表达抑制肺癌细胞增殖、转移、侵袭并促进细胞凋亡,同时可增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬。第三部分氢气抑制肺癌生长及CD47、CDC42表达的动物实验目的:体内实验探究氢气处理对肺癌肿瘤病理学变化的影响及CD47和CDC42表达的影响。方法:荷瘤小鼠分为对照组10只、氢气组10只和顺铂组10只,收集各组小鼠肿瘤组织,分别通过伊红-苏木精染色(Hematoxylin&eosin,HE)和免疫组织化学染色技术(Immunohistochemical stainin,IHC)评估各组小鼠肿瘤组织的病理学状态及CD47和CDC42蛋白的表达水平。结果:1.氢气干预同顺铂治疗效果一致,均可明显缓解肿瘤组织细胞异质。2.氢气干预可明显降低荷瘤小鼠肿瘤组织中CD47和CDC42的表达水平。小结:本部分体内实验进一步表明氢气干预可通过降低CD47/CDC42的表达抑制肺癌进展。氢气或许有望成为CD47蛋白高表达的肺癌患者的有效治疗方法。结论:1.氢气处理能显著下调CD47的蛋白和m RNA的表达;2.氢气干预可明显抑制肺癌细胞增殖、转移和侵袭能力,并诱导细胞凋亡,增强巨噬细胞对肺癌细胞的吞噬作用;3.CD47敲除可协同氢气处理共同抑制肺癌细胞增殖、转移和侵袭能力,并诱导细胞凋亡;4.CD47过表达可显著削弱氢气的抗肿瘤作用;5.氢气干预同顺铂治疗效果一致,均可明显缓解肿瘤组织细胞异质。
