小白菜(Brassicachinensis L.)是一种重要的并在中国广泛栽植的叶菜类蔬菜。同时,小白菜具有较强的镉积累能力。探究小白菜的耐镉机制并且应用安全有效的手段提高小白菜的耐镉性及降低小白菜可食部分镉含量是保障蔬菜农产品食品安全的重要措施。近年来,比较不同耐镉性及镉积累能力的蔬菜,并探究品种间的差异机制一直是探索蔬菜耐镉机制的研究热点。并且,以富氢水(hydrogen-richwater,HRW)为主要供给形式,探究H2在植物耐镉机制中所起的生物学功能已成为新的研究热点,但是H2在植物抗镉过程中所起的分子机制尚不明确。本文以小白菜为试验材料,初步探究了不同品种小白菜耐镉性差异的机制,并且研究了 HRW缓解小白菜镉胁迫并降低小白菜镉积累的机制,取得了以下主要结果:1.分析了 9个不同品种小白菜镉耐性。采用水培的方式,分别比较了不同品种小白菜分别在0、5、10和50 μM CdCl2处理下的生长情况及Cd积累情况。最终筛选出镉敏感型且高积累小白菜-‘上海青’、耐镉型且高积累小白菜-‘抗热605’和耐镉型且低积累小白菜-‘五月慢’。通过对镉含量的比较最终筛选出高镉积累型小白菜-‘上海青’和‘抗热605’、低镉积累型小白菜-‘五月慢’。并且通过非损伤技术(NMT,Non-invasive micro-test technology)的检测发现,‘抗热605’根部Cd2+流速最大,‘五月慢’的根部Cd2+流速最小,.进一步表明‘抗热605’根部镉吸收能力较强,而‘五月慢’根部镉吸收能力较弱。qRT-PCR结果显示,与镉吸收相关的BcZIPs家族基因的高表达可能导致了‘抗热605’对于镉的吸收能力较高;而‘五月慢’富集镉能力较弱的原因可能是与镉吸收相关的转运体表达量较低有关。除此以外,在相同镉处理下,BcGSTUs家族基因的表达量因小白菜品种不同而不同,其中BcGSTUs家族基因在‘抗热605’中的表达量较高。为了确定BcGSTUs在小白菜镉耐性中所起的作用,我们从‘抗热605’中分离出表达量较高的BcGSTU4、BcGSTU11、BcGSTU12和BcGSTU22,并转入镉敏感型酵母突变体中,结果显示BcGSTU11具有缓解酵母镉毒害的作用。根据以上试验结果我们推测:‘抗热605’具有较高的镉耐性可能是由于BcGSTUs的表达较高;由于BcGSTUs家族基因表达量较低,所以‘上海青’表现出了较低的耐镉性。2.与单独Cd处理相比,HRW能够明显缓解Cd对小白菜产生的生长抑制,并且显著降低了小白菜地上部和地下部的Cd含量,但是HRW对小白菜Cd的转运系数没有显著影响。同时,HRW对Cd胁迫下小白菜地上部和地下部的Fe、Zn含量有显著的影响。随后,运用高通量测序(RNA-sequencing analysis)技术,从转录水平上详细阐述了 HRW缓解小白菜Cd胁迫并降低小白菜Cd积累的生理机制。转录组结果显示HRW能够显著影响Cd胁迫下小白菜对于亚铁离子的还原性以及对Zn2+的结合能力,并且提高了与Cd解毒(GSTUs、GSH-Pxs、Glutaredoxins)相关基因的表达。结合GO和KEGG功能分析的结果,最终筛选出差异表达倍数较高的两个编码金属离子转运的转运体基因:BcIRT1和BcZIP2。随后利用酵母突变体功能回补实验发现BcIRT1和BcZIP2加剧了酵母对于各金属胁迫的敏感性,并提高了酵母对Cd2+、Mn2+、Zn2+和Fe2+的积累能力,因此推测BcIRT1和BcZIP2具有转运Cd2+、Mn2+、Zn2+和Fe2+的功能。对BcIRT1和BcZIP2基因表达谱的分析结果显示,随着处理时间的逐渐延长,HRW对BcIRT1和BcZIP2表达量的抑制作用就越明显。并且随着Cd胁迫浓度的逐渐增加,HRW对BcIRTI和BcZIP2表达量的抑制作用也越明显。
综上所述,这些研究结果初步阐明了 HRW可能是通过抑制与Cd吸收相关转运体基因BcIRT1和BcZIP2的表达来降低小白菜对于Cd的吸收。3.离子含量检测及Cd2+荧光染色结果表明了,不同Cd浓度处理下,HRW能够显著降低小白菜地上部及地下部Cd的积累,并通过NMT进一步确定HRW能够降低小白菜根部对Cd2+的吸收。同时,荧光定量(qRT-PCR)与半荧光定量(Semi-qPCR)的结果表明,HRW能够显著抑制Cd胁迫下小白菜根部BcIRT1和BcZIP2的表达,该结果与转录组的结果相一致。对BcIRT1和BcZIP2生物信息学的分析结果显示,BcIRT1和BcZIP2分别与AtIRT1和AtZIP2具有很高的同源性,并具有相似的蛋白结构,因此我们推测BcIRT1和AtIRT1、BcZIP2和AtZIP2具有相似的功能。随后构建相应的拟南芥转化体系,并获得纯合转基因拟南芥。与单独Cd处理相比,HRW显著降低了 WT、回补株系(ComIRT1、ComZIP2)和过表达株系(OEIRT1、OEZIP2)株系拟南芥中的Cd含量。并通过NMT技术,进一步发现HRW能够降低WT和转基因拟南芥根部Cd2+流速,而对irt1和zip2突变体拟南芥根部Cd2+流速没有显著影响。此外,HRW在不同程度上影响了 Cd与Fe以及Cd与Zn之间的离子相互竞争力。综上所述,HRW降低小白菜和拟南芥Cd含量可能是由于HRW降低了与Cd吸收相关转运体基因IRT1和ZIP2的表达。
