研究背景和目的： 肝脏缺血再灌注(ischemia/reperfusion I/R)损伤是缺血的肝组织恢复血供后使肝脏缺血性损伤进一步加重的现象,涉及自由基产生、中性粒细胞浸润及炎性介质大量释放等一系列病理生理过程。由于肝脏外科手术经常需要阻断肝门,不可避免的会造成肝脏I/R,从而加重术后肝功能损伤甚至导致肝脏衰竭。许多研究表明氧化应激在缺血再灌注肝损伤发生发展过程中有着重要的作用,抑制氧自由基的产生或通过生化反应清除氧自由基可以有效减轻肝损伤。 在生理情况下,生物体内的自由基的产生与被清除,维持在一个稳定水平上。如果自由基的产生与清除失衡,则会导致氧化应激反应。有研究发现氢气有选择性抗氧化作用,能够有选择性地清除亚硝酸阴离子和羟自由基。第二军医大学孙学军教授课题组通过高压将氢气溶解于生理盐水中成功制备了氢生理盐水并申请了专利,这项技术可以使氢分子的研究更加标准化,介于缺血再灌注肝损伤机制和氢生理盐水独特的选择性抗氧化性质,本课题以大鼠肝缺血再灌注损伤为模型,拟验证氢生理盐水对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用,并初步探讨其作用的机制。 研究方法 1.通过无创血管夹夹闭肝中叶和左叶的门静脉和肝动脉,使约70%的肝脏缺血,90min后去除血管夹,恢复肝血流180min建立大鼠肝缺血再灌注损伤模型,再灌注180min后收集血浆及肝脏标本。 2.HE染色观察肝脏形态学改变及炎症细胞浸润。 3.运用自动生化分析仪检测肝功能。 4.比色法检测肝组织中MDA、SOD、GSH含量,观察肝组织氧化反应程度。 5.ELISA法检测肝组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、HM(GB1活性观察肝组织炎性反应程度。 6.差速离心法分离肝细胞线粒体及胞浆。 7.透射电镜观察肝细胞线粒体改变。 8.比色法检测线粒体中MDA、GSH、GSSG含量,观察线粒体氧化反应程度。 9.荧光分光光度计检测线粒体ATP变化,Clark氧电极法检测线粒体呼吸功能,观察线粒体损伤情况。
结果 (一)氢生理盐水能使I/R诱导的肝损伤明显减轻。 1.氢生理盐水组谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平明显低于生理盐水对照组。 2.HE检测显示氢生理盐水组损伤后肝脏形态结构好于生理盐水对照组,中性粒细胞浸润少于生理盐水对照组。 (二)氢生理盐水能有效抑制缺血再灌注肝组织氧化应激及炎性反应 1.氢生理盐水组肝组织MDA水平明显低于生理盐水对照组,而SOD活力、GSH含量明显高于生理盐水对照组。 2.氢生理盐水组肝组织中TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1活性明显低于生理盐水对照组。 (三)氢生理盐水能明显减轻I/R诱导的肝细胞线粒体损伤和氧化反应 1.氢生理盐水组线粒体中MDA、GSSG水平低于生理盐水对照组,而GSH含量则高于生理盐水对照组。 2.氢生理盐水组线粒体ATP含量高于生理盐水对照组,氢生理盐水能显著提高线粒体呼吸控制率及磷氧比,改善线粒体呼吸功能。 结论 本课题以大鼠肝缺血再灌注损伤模型为研究对象,验证氢生理盐水对肝脏缺血再灌注肝功能损伤的保护作用并初步探讨其作用的可能机制,得到以下结论： 一、氢生理盐水能明显减轻缺血再灌注诱导的肝损伤。 二、氢生理盐水能有效抑制缺血再灌注肝组织氧化应激。 三、氢生理盐水能有效减轻缺血再灌注肝组织炎性反应。 四、氢生理盐水能明显减轻缺血再灌注诱导的肝细胞线粒体的氧化应激。 五、氢生理盐水能抑制肝细胞线粒体ATP消耗、呼吸控制率及磷氧比的降低来发挥肝损伤保护作用。 本论文以大鼠肝缺血再灌注损伤为实验模型,应用多种实验方法研究了氢生理盐水在体内抗氧化、抑制炎性反应、减轻肝细胞线粒体损伤的功能,初步验证了氢生理盐水能有效减轻缺血再灌注肝损伤,并能抑制肝组织氧化应激和炎性反应的作用,进一步研究发现氢生理盐水还可以减轻缺血再灌注诱导的肝细胞线粒体的氧化损伤,并通过增强线粒体呼吸功能发挥肝损伤保护作用,为氢生理盐水应用于临床治疗缺血再灌注肝损伤提供了理论依据和实验支持。
