人类寿命长短与衰老密切相关。机体成熟后,衰老会随着年龄的增长而加快并出现生理功能不可逆转的衰退。研究发现,氢气具有清除自由基、抗氧化、抗炎和抗代谢紊乱等多种生物活性。本实验以模式生物-秀丽隐杆线虫研究对象,胡桃醌构建氧化应激模型,探究氢气抗衰老的活性及其作用机制。具体研究内容如下:(1)首先以野生型秀丽线虫为研究对象,20℃环境下生长,探究氢气对N2线虫寿命的影响。研究表明:氢气干预后线虫寿命最长可达30h,对照组寿命最长可达22h,实验组平均寿命和最高寿命均高于对照组。经过富氢水处理30h后,低浓度富氢水和高浓度富氢水处理下线虫寿命分别提高了21.4%和26.7%,同时,氢气可以有效抑制线虫体内脂褐素的累积。机体内脂褐素水平的高低反应了机体衰老的程度,随着寿命的增加,机体内脂褐素逐渐积累增多,通过测定脂褐素的光密度值评估脂褐素积累的程度。结果表明氢气有效抑制线虫体内脂褐素的积累,并具有延缓衰老,延长其寿命的效果。(2)神经退行性疾病造成机体的损伤通常是不可逆的,随着机体的衰老神经系统功能逐渐下降。阿尔茨海默病多发于中老年人,其发生机制与神经细胞受损出现炎症进而产生的氧自由基有关。有研究表明淀粉样蛋白-β(Aβ)毒性会引发在阿尔茨海默病中出现的突触丢失和随后的神经元退化。CL4176线虫是一种在肌肉组织中表达人的Aβ肽的转基因线虫,Aβ沉积在线虫肌肉细胞中逐渐积累显现出进行性瘫痪的表型。
该实验通过这一模型证实了氢气在线虫体内具有抵抗淀粉样蛋白毒性的作用,低浓度氢气干预下的转基因线虫CL4176对Aβ诱导的瘫痪无显著差异,高浓度氢气干预下的转基因线虫CL4176表现出Aβ诱导的瘫痪延迟,表明高氢气可以缓解β-淀粉样蛋白诱导的毒性,从而说明氢气具有缓解老年病阿尔茨海默病中出现的突触丢失和随后的神经元退化的作用。因此,进一步证明了氢气具有抗衰老的活性。(3)近年来一些研究表明,有些物质在延长寿命的同时其生殖能力和身体生长发育能力下降。该研究结果表明氢气延长线虫寿命的同时对其总产卵数和体长没有影响,表明氢气不会影响生殖能力和身体发育生长。在寿命实验的同时,观察秀丽线虫的运动能力。因为衰老引起肌肉退化导致线虫运动能力的下降。氢气环境培养线虫15天后与对照处理组相比,氢气组线虫头部摆动次数均多余对照组,差异显著;氢气组身体弯曲次数均多余对照组,第7天线虫身体弯曲次数/20s由12最多增加至16差异显著,后期无明显差异;咽泵频率/min第三天无明显变化,第七天由150增加至180,差异显著。说明氢气对线虫的运动能力具有积极作用,从而使线虫更具有抗衰老的能力。(4)有研究表明,秀丽线虫的寿命与其在外界压力应激中的抵抗力有关。该研究采用胡桃醌来模拟内源性氧化应激,该实验通过检测线虫的存活个数发现,在浓度为300μmol/L胡桃醌氧化应激环境下生存13h后,对照组存活率分别为10%,试验组存活率分别18%和20%。经过富氢水处理24h后,线虫抵抗由胡桃醌诱导引起的氧化损伤的能力显著提高。实验结果说明,氢气能显著提高线虫在氧化应激环境下的抵抗力。在胡桃醌氧化应激的条件下胰岛素通路daf-2突变体线虫、生殖腺通路glp-1突变体线虫存活曲线均无明显差异,氢气不能提高其抗氧化能力,初步说明氢气的抗氧化活性依赖于胰岛素与生殖腺信号通路。饮食限制通路eat-2、线粒体信号通路clk-1突变体存活曲线较对照组有所延长,抗氧化应激能力增强,初步说明氢气抗氧化活性不依赖于饮食限制与线粒体信号通路。(5)线虫抵抗氧化应激的能力跟SOD酶与GSH-Px酶的表达水平有关,提高酶的活力能够增强线虫体内抗氧化应激能力进而延长其寿命。因此,我们首先研究氢气对线虫体内SOD酶和GSH-Px酶活力的影响。结果显示,在高浓度富氢水处理下,线虫体内SOD酶的活力较对照组提高了24.5%,效果显著;其他无明显差异。初步说明氢气抗氧化的作用机制可能是激活了SOD酶的活力。为了检测SOD酶活性的增强是否因为氢气诱导酶基因表达量的变化,进一步探究了sod-3基因表达情况,结果表明,氢气浓度越高sod-3::GFP的荧光强度越强,差异越明显。表明氢气促进sod-3基因表达量上调,酶的活力增强,从而提高线虫抵抗氧化应激的能力,延长寿命。(6)daf-16是IIS信号通路中的关键基因,通过试验氢气对突变体线虫daf-16寿命的影响来评估氢气延长线虫寿命的效果与IIS信号通路有关。结果表明,氢气不能延长daf-16线虫寿命。并且线虫体内daf-16表达水平上调,daf-2表达水平下调,表明氢气延长寿命的作用机制可能与IIS信号传导通路中关键基因daf-16和daf-2的表达水平有关。sod-3基因为氧化应激信号通路中的调控基因,sod-3基因表达上调,表明氢气可能是由于激活了通路中daf-16、sod-3、daf-2的基因表达,从而具有调控抗逆性蛋白表达的功能来抵抗机体内外对线虫不利的因素,进而能延缓衰老。也有很多文献报道饮食限制能延长线虫寿命。因此,我们测定了饮食限制信号通路中的关键基因eat-2基因表达水平。结果eat-2基因表达水平上升,说明氢气抗衰老的作用与饮食限制通路无关。
