研究背景:高同型半胱氨酸血症(Hyperhomocysteinemia,HHcy)在我国发病率较高,HHcy与多种疾病的发生发展密切相关,如心血管疾病、神经和精神疾病、慢性肾病、脂肪肝等,是多种疾病的独立危险因素。其主要通过氧化应激损伤、DNA甲基化和含硫化合物代谢异常等多种机制影响细胞功能,进而导致多种组织和器官的病理变化。目前对于HHcy的管理与治疗策略,临床上主要针对叶酸、维生素B6、维生素B12等关键辅酶不足的情况进行营养干预治疗。虽然该干预措施对降低同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)水平的疗效没有争议,但干预周期长以及对于疾病预后的改善普遍低于预期是其主要缺点。因此,目前亟需一种可以降低Hcy水平并且显著改善患者预后,降低并发症罹患风险的高效干预策略。氢医学在近年来迅速发展,氢气已经被证实能对心血管疾病、慢性肾病、高血压、代谢综合征等疾病产生积极作用,并以安全、体积小、作用迅速、无毒副反应等优点引起广泛的关注。多种动物病理模型证实,氢气疗效显著且无明显不良反应,大量的研究表明,氢气既可以直接与活性氧自由基反应减少氧化应激发挥生物学效应,又可以通过调节基因表达发挥保护效应。因此,氢气干预在慢性代谢性疾病领域具有广阔的应用前景。我们前期的研究发现氢气干预可以达到降低HHcy大鼠的血浆Hcy水平和改善脂肪肝的效果,并通过组学筛选到表达差异基因PARK7(DJ-1)和甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸通路参与其中,氢干预后DJ-1表达显著上调,甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸通路显著激活,但其具体机制尚不清楚,有待进一步研究。研究目的:观察氢气干预对高蛋氨酸饮食所致HHcy的影响,探讨氢气降低Hcy改善肝功能的作用;利用DJ-1 KO动物和细胞模型,探讨DJ-1在氢气改善HHcy中的作用及机制,并通过PPAR-γ激动剂干预在动物和细胞水平进一步验证其调控机制。
研究内容及方法:1.验证HMD对动物和细胞损伤效应(1)小鼠HHcy模型的建立:将SPF级小鼠随机分为2组:CHOW组和HMD组,CHOW采用AIN-93G对照饲料,HMD组采用AIN-93G+2%蛋氨酸饲料,建立HHcy模型,持续12周;(2)细胞HHcy模型的建立:AML-12细胞分为四组:普食组(CHOW)、蛋氨酸组(HMD),Met培养液(20mmol/L,50mmol/L,100mmol/L,母液浓度为200mmol/L,使用时用DMEM:F12=1:1培养基做相应稀释);(3)利用Western Blot(WB)技术检测DJ-1及Nrf2蛋白表达;(4)利用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)技术检测Hcy来源及代谢关键酶的转录表达。2.探究DJ-1对Hcy代谢的调控作用(1)DJ-1 KO动物模型:DJ-1 KO动物模型:由赛业(苏州)生物科技有限公司购入,繁殖后扩群,经基因型鉴定后挑选+/+为对照组(WT),-/-为敲除组(KO);(2)DJ-1 KO细胞模型:从上海吉凯基因科技有限公司构建慢病毒载体,感染AML-12细胞后进行鉴定敲除效率;(3)利用酶循环法检测动物血浆及细胞同型半胱氨酸(t Hcy)的浓度;(4)利用Cell Counting Kit 8(CCK-8)法检测AML-12细胞的各组细胞活力。3.Rog干预对DJ-1及Hcy代谢的影响(1)Rog干预细胞及动物模型构建:使用20mmol/L的rosiglitazone培养AML-12细胞并检测其对DJ-1及Hcy代谢关键酶的影响;(2)检测动物肝脏功能指标和血浆脂质代谢及t Hcy水平;(3)苏木精-伊红(Hematoxylin-Eosin,HE),油红(Oil Red)染色观察动物肝脏组织病理学改变及肝脏脂肪变性。研究结果:1.HMD对小鼠肝功能和DJ-1表达的影响(1)HMD小鼠t Hcy显著升高、体重显著下降、肝脏指数显著升高;(2)HMD小鼠肝脏ALT、AST显著升高,肝脏受损;(3)HMD小鼠肝脏TC、TG,血浆TC、TG显著升高,肝脏脂质代谢受损;(4)肝脏病理组织切片观察到HMD小鼠肝脏损伤并伴有脂肪肝;(5)HMD小鼠肝脏DJ-1蛋白和m RNA表达显著下降。2.HMD干预DJ-1 KO小鼠对Hcy代谢影响(1)DJ-1 KO小鼠更不耐受HMD,t Hcy显著升高;(2)DJ-1 KO小鼠肝脏Hcy代谢转硫途径和GSH合成途径关键酶m RNA表达显著降低;(3)肝脏转录组学结果表明,DJ-1 KO小鼠HMD干预后,甘氨酸-丝氨酸-苏氨酸代谢通路和Vit B6代谢显著下调;DJ-1 KO小鼠维生素合成利用和脂肪酸代谢受损,对Hcy和脂肪酸代谢能力下降。3.DJ-1敲除对细胞内Hcy代谢作用及机制研究(1)HMD干预细胞DJ-1蛋白和m RNA表达显著下降,细胞活性下降,Nrf2转录水平显著下降;(2)HMD干预细胞Hcy代谢合成途径关键酶转录表达显著下降,再甲基化途径关键酶转录表达显著下降,转硫途径和GSH合成途径关键酶转录表达有上升趋势;(3)HMD干预DJ-1 KO细胞活性显著下降,不耐受HMD;(4)DJ-1 KO细胞Nrf2 m RNA显著下降,Hcy来源关键酶Mat2a转录表达显著下降,再甲基化途径关键酶MTR、MTHFR转录表达显著下降,转硫途径和GSH合成途径关键酶转录表达显著下降。4.动物和细胞rosiglitazone干预模型的构建及对DJ-1和Hcy代谢的影响研究(1)Rog干预下调AML-12细胞DJ-1蛋白和转录表达;(2)Rog干预上调AML-12细胞Nrf2,并促进Hcy代谢转硫途径和GSH合成;(3)Rog干预导致HHcy小鼠血浆Hcy进一步升高;(4)Rog干预导致HMD小鼠肝脏代谢损伤和脂肪肝进一步加重。
研究结论:1.HMD饮食会对小鼠造成肝脏功能损伤和脂肪肝,并显著抑制肝脏DJ-1的表达。2.氢可以上调DJ-1表达,DJ-1 KO细胞和小鼠不耐受HMD干预,DJ-1对Hcy的代谢具有正向调节作用。3.DJ-1 KO小鼠GSH合成和Vit B6代谢通路受阻,Hcy代谢转硫途径、再甲基化途径减弱,提示DJ-1对Hcy代谢的关键作用。4.PPAR-γ激动剂Rog具有抑制DJ-1表达,导致Hcy代谢障碍并加重HHcy症状的作用。
