目的探讨氢气对氧化损伤肠上皮细胞的保护作用及其分子机制,旨为临床上新生儿坏死性小肠结肠炎(NEC)的防治提供可能的治疗靶点。
方法以人和大鼠肠上皮细胞Caco-2细胞株与IEC-6细胞株为研究对象,根据是否采用抗霉素A和氢气处理,将上述细胞分为3组:抗霉素A(-)/H2(-);抗霉素A(+)/H2(-);抗霉素A(+)/H2(+),分别为对照组(antimycin A 0μg/ml,H2 0mM)、抗霉素A组(antimycinA 30μg/ml,H2 0mM)及氢气组(antimycinA 30μg/ml,H2 0.6mM)。利用Western Blot、Real-time PCR、流式细胞仪、酶联免疫吸附法实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)等研究方法检测各组以下指标:(1)氧自由基(O2-?、H2O2和?OH)水平;(2)线粒体膜电位;(3)氧化代谢产物丙二醛(MDA)和8-羟基鸟嘌呤(8-OH-G);(4)细胞凋亡率和乳酸脱氢酶(LDH)活性;(5)促炎症因子(IL-6、TNF-α、IL-1β)、抗炎症因子(IL-10)、转录因子核因子-E2相关因子2(Nrf2)及其下游靶基因(HO-1、SOD、Cat、GPx)表达;(6)磷酸化Nrf2蛋白表达。结果与抗霉素A组比较,氢气可以显著降低由抗霉素A诱导的氧化损伤,表现为降低细胞内氧自由基水平(O2-?、H2O2和?OH分别为抗霉素A组的0.236倍、0.456倍和0.124倍),使线粒体膜电位升高,显著降低细胞内氧化代谢产物的含量,而且降低细胞的凋亡率(对照组、抗霉素A组、氢气组细胞凋亡率分别为5.8%、60.1±5.89%、23.7±3.48%)及乳酸脱氢酶(LDH)活性。另外,氢气处理可以降低甲萘醌和Fenton反应诱导的肠上皮细胞的凋亡率及乳酸脱氢酶活性。最后,氢气处理可以增加转录因子Nrf2磷酸化水平,并且氢气组中炎症因子的含量较抗霉素A组显著下降。在抗霉素A组中,Nrf2下游基因HO-1,SOD,Cat,GPx的表达都有所升高,而氢气的处理使转录因子Nrf2下游靶基因表达显著增强。
结论氢气能够降低抗霉素A诱导的肠上皮细胞的氧化损伤,表现为降低了细胞内活性自由基含量,修复线粒体膜电位,降低氧化代谢产物,抑制细胞凋亡并降低细胞内乳酸脱氢酶活性。氢气的这一保护作用可能是通过调控Nrf2-ARE信号通路实现的。
