研究背景和目的多发性硬化(Multiple sclerosis,MS)是以中枢神经系统炎性脱髓鞘为病理特点的慢性自身免疫性疾病。多发性硬化病因不明,其发病过程与CD4+T细胞分化密切相关。实验性自身免疫性脑脊髓炎动物(Experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是目前研究多发性硬化最为适宜的模型,对于疾病发生过程中异常免疫反应有较好模拟作用。在多发性硬化和实验性自身免疫性脑脊髓炎发病过程中,激活的CD4+T细胞在髓鞘抗原刺激下分化成分泌不同炎性因子的辅助型T细胞亚群(Helper T cells,Th cells)。促炎性辅助型T细胞和抑炎免疫调节型T细胞之间的免疫失衡,是导致疾病发生发展的主要原因。氢气是自然界中一种无色无味的气体。近年来发现氢气具有选择性抗氧化作用,因为安全简单,可能适用于多种急慢性病的治疗。由于氢气分子量小且缺乏极性,使得氢分子具有强大的组织扩散能力,可迅速穿过血脑屏障抵达中枢神经系统。但扩散能力强也容易降低氢气的体内存留时间和剂量,采用吸入氢气的方法可保证在体存留时间和给气剂量,对于发挥氢气的治疗作用有其独特的优势。
本课题研究目的在于证实氢气吸入对于实验性自身免疫性脑脊髓炎的治疗作用,并探究保护作用机制。本研究主要分为三个部分:第一部分呼吸氢气对实验性自身免疫性脑脊髓炎动物的治疗作用目的:中枢神经系统炎性细胞的浸润和大范围的髓鞘脱失以及轴索损伤是多发性硬化和实验性自身免疫性脑脊髓炎的病理学特点。氢气作为一种新型抗氧化剂越来越受到人们重视。本实验拟采用实验性自身免疫性脑脊髓炎动物为研究对象,通过给与高浓度氢气吸入方式,探讨氢气对于实验性自身免疫性脑脊髓炎动物的治疗作用。
方法:建立实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型,采用随机数字表法共分为4组(n=12):正常组(Ctrl组),实验性自身免疫性脑脊髓炎组(EAE组),实验性自身免疫性脑脊髓炎吸入高浓度氢气组(EAE+HCH组),实验性自身免疫性脑脊髓炎吸入氮氧混合气组(EAE+HCN组)。EAE+HCH组和EAE+HCN组小鼠自致免后第12天开始每日吸入氢氧混合气或氮氧混合气2个小时。每日进行神经行为学评分和体重称量;致免后第21天进行老鼠处死和组织取材的工作,采用H&E染色和勒克斯速蓝(Luxol fast blue,LFB)染色进行组织形态学的观察评分;采用免疫组化方法观察脊髓中T细胞数量的变化;通过酶联免疫吸附试验检测脊髓匀浆裂解液中炎性因子含量改变。结果:与Ctrl组相比,EAE组第9天开出现尾部肌肉张力丧失,逐渐扩散到单或双下肢,同时伴随体重下降,组织形态学观察到中枢神经系统腰膨大部分炎性细胞浸润和大量脱髓鞘和轴索损伤,相同切片区域中大量CD4+T细胞浸润,脊髓裂解液中炎性因子TNF-α、IFNγ和IL-1β含量升高;与EAE组相比,EAE+HCN组各种检测指标均未见明显改变;与EAE组相比,EAE+HCH组神经行为学和体重缺失有所缓解,中枢神经系统炎性细胞浸润和脱髓鞘情况得到明显改善,T细胞数量减少,炎性因子TNF-α、IFNγ和IL-1β含量降低而抗炎因子IL-10含量升高。结论:氢气吸入能改善中枢神经系统炎性细胞浸润和脊髓髓鞘脱失,减少中枢神经系统T细胞浸润,降低中枢神经系统炎症水平。结果显示,吸入高浓度氢气对实验性自身免疫性脑脊髓炎具有治疗效应。第二部分呼吸氢气对实验性自身免疫性脑脊髓炎动物免疫细胞的影响及机制探讨目的:有关多发性硬化的发病机制尚不完全明确,异常免疫反应在多发性硬化发病过程中起到重要作用。氢气作为一种抗氧化、抗炎和抗凋亡的新型治疗手段,吸入氢气是否对免疫细胞有调节作用是我们这一部分探究的内容。通过建立实验性自身免疫性脑脊髓炎动物,探讨氢气对免疫细胞以及辅助型T细胞的影响。方法:建立实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型,采用随机数字表法共分为两组(n=12):实验性自身免疫性脑脊髓炎组(EAE组)和实验性自身免疫性脑脊髓炎吸入高浓度氢气组(EAE+HCH组)。EAE+HCH组自致免后第12天开始每日吸入高浓度氢气2个小时。实验第19天进行小鼠处死和组织取材工作,将小鼠脊髓和脑以及小鼠脾脏分别制备单细胞悬液,体外MOG 35-55刺激培养。48小时后流式细胞学检测各型免疫细胞的数量和比例;收集培养液上清液进行酶联免疫吸附法分析细胞因子;采用RT-PCR进行mRNA转录因子水平测定。结果:与EAE组相比,EAE+HCH组小鼠的CD4+T细胞和CD11b+小胶质细胞/巨噬细胞在中枢神经系统和脾脏细胞的数量和比例都降低,CD19+细胞的数量和比例两组之间并无明显差异;与EAE组相比,EAE+HCH组的Th17细胞在中枢神经系统和脾脏的数量和比例均下降,ELISA显示IL-17的含量减少,RT-PCR结果显示RORγt表达水平下降。其他辅助型T细胞,包括Th1细胞、Th2细胞和Treg细胞数量,以及细胞因子和转录因子水平在两组之间不存在差异。结论:高浓度氢气吸入可减少CD4+T和CD11b小胶质细胞/巨噬细胞在中枢神经系统和脾脏中的数量和比例;高浓度氢气吸入可减少Th17数量和比例,减少其分泌的细胞因子以及转录水平。第三部分分子氢通过调节ROS/NLRP3通路发挥对Th17细胞分化的抑制作用目的:分泌IL-17炎性因子的Th17细胞在多发性硬化和实验性自身免疫性脑脊髓炎发病过程中发挥非常重要的作用。NLRP3及其相关蛋白分子与多发性硬化和实验性自身免疫性脑脊髓炎的疾病严重程度密切相关。本部分拟采用体内和体外实验,来探究氢气对于Th17细胞分化的抑制作用是否通过调节ROS/NLPR3通路引起。方法:本部分研究分为两个阶段:第一阶段,建立实验性自身免疫性脑脊髓炎动物,采用随机数字表法共分为两组(n=12):实验性自身免疫性脑脊髓炎组(EAE组),实验性自身免疫性脑脊髓炎吸入高浓度氢气组(EAE+HCH组),EAE+HCH组自致免后第12天开始每日吸入高浓度氢气2个小时。另外设有正常对照组(Ctrl组,n=12)。于实验第19天进行组织取材,小鼠脾脏制备单细胞悬液进行体外培养。48小时后采用流式细胞术分析CD4+T细胞中DCFHDA的含量变化;采用western blot的方法检测NLPR3相关蛋白的表达水平。第二阶段:从野生型小鼠脾脏制备的单细胞悬液进行磁性负性分离na?ve T细胞,再进行Th17细胞定向分化,分别给与ATP和(或)富氢培养基处理。采用流式细胞术分析Th17细胞的数量,采用western blot检测NLRP3相关蛋白表达水平。
结果:与Ctrl组相比,EAE组的CD4+T细胞中ROS含量明显上升,而氢气吸入(EAE+HCH组)可以减少CD4+T细胞中ROS的含量。与EAE组相比,EAE+HCH组的CD4+T细胞中IL-1β、Caspase-1和NLRP3蛋白表达水平下降。在体外Th17细胞定向分化过程中实验中,经ATP处理的Th17细胞数量增加,IL-1β、Caspase-1和NLRP3蛋白表达含量升高;加入富氢培养基处理后,Th17细胞数量减少,IL-1β、Caspase-1和NLRP3蛋白表达水平降低。结论:氢气通过减少CD4+T细胞内ROS的水平,发挥对NLRP3及其下游蛋白Caspase-1和IL-1β的抑制作用,进一步导致了Th17细胞分化数量的降低。综上所述,呼吸氢气可改善实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠神经功能损伤和体重丧失,减轻中枢神经系统炎症反应和髓鞘脱失;氢气可降低CD4+T细胞和CD11b+小胶质细胞/巨噬细胞在中枢神经系统和脾脏中数量和比例,减少实验性自身免疫性脑脊髓炎动物中Th17细胞数量比例及特异性炎性因子表达;氢气能够通过降低CD4+T细胞内活性氧自由基的水平,抑制NLRP3炎性小体激活和下游效应因子表达,发挥对Th17细胞分化过程抑制作用。研究结果提示,高浓度氢气吸入作为一种给氢方法,对实验性自身免疫性脑脊髓炎具有治疗作用,其机制可能是氢气抗氧化抑制了NLRP3炎性小体激活和效应因子释放,导致了Th17细胞分化数量的减少,进而缓解了免疫炎症反应。
