高压氧的镇痛效应及氢气对肺的氧化损伤的防治研究

刘书林

第二军医大学

第一部分:高压氧的镇痛效应及机制研究疼痛是一种复杂的生理心理活动,是临床上最常见的症状之一,并可造成器官功能障碍。剧烈和长期的疼痛会影响到人体各器官系统的功能,如引起睡眠障碍、消化功能受抑制、血压升高、心率加快(有心脏病者可致心率失常)、呼吸急促(胸、腹部疼痛时通气受限)、植物神经功能紊乱、关节功能下降和心理障碍等,造成药物滥用、自杀等社会问题。如何进行安全、有效的镇痛,对减轻病人痛苦、提高患者生活质量具有重大意义。虽然高压氧(HBO)尚未用于临床镇痛,但已有多个临床观察发现HBO的镇痛效应,包括对复杂区域疼痛综合征、纤维肌痛、慢性骨髓炎、偏头痛和丛集性头痛的镇痛效应等。
本课题重点研究高压氧的镇痛效应及机制。


在本研究的第一部分,我们发现,单次的HBO处理可产生急性镇痛作用,且镇痛效果和氧气的压力之间存在显著的线性关系。我们进一步研究单次HBO处理诱导的镇痛效应的时程特点,结果发现,在暴露后即刻、10 min、30 min、60 min和90 min后,高压氧的镇痛效应都可以保持在80%左右。120分钟后下降到50%以下,在180分钟时下降到20%左右。更有意义的是,给予小鼠每天1个小时的HBO处理,连续给予4次后,可以诱导独特的双相镇痛效应:(1)早期镇痛:HBO处理后1小时后出现,持续约8小时;(2)晚期镇痛:早期镇痛1天后开始出现,持续时间长达近3周。在研究的第二部分,我们重点研究了NOS在高压氧的镇痛效应中的作用。首先,我们在HBO暴露结束后分别给予小鼠非特异性NOS抑制剂、n NOS抑制剂、e NOS抑制剂和i NOS抑制剂,然后观察它们对单次高压氧的镇痛效应的影响。结果发现,非特异性NOS抑制剂和n NOS抑制剂都显著抑制了高压氧的镇痛效应。另外,单次给予非特异性NOS抑制剂和n NOS抑制剂都显著抑制了反复HBO处理诱导的早期镇痛效应,而持续给予非特异性NOS抑制剂和n NOS抑制剂显著抑制了反复HBO处理诱导的晚期镇痛效应。在NOS基因敲除小鼠中,只有n NOS基因敲除小鼠的镇痛效应得到了显著抑制。此外,我们发现HBO暴露1小时后,皮层、脑干和脊髓中的NO含量显著增高。而当小鼠反复HBO暴露后休息7天后,在各个脑组织内,高压氧气暴露组的NO含量无显著变化。最后,Western blot结果显示,小鼠暴露于高压氧气后,小脑、脑干和脊髓的n NOS的含量显著增高。在研究的第三部分,我们重点研究GABA受体和5-HT1A受体在其中的作用。我们首先研究了GABA受体拮抗剂对单次HBO处理引起的镇痛作用的影响。结果发现,侧脑室注射GABAA受体拮抗剂引起镇痛效应的剂量相关性降低,而侧脑室注射GABAB受体抑制剂对单次HBO处理引起的镇痛作用几乎没有影响。对于反复HBO处理,末次HBO处理3小时后进行侧脑室注射GABAA受体抑制剂和GABAB受体抑制剂,其对HBO处理诱导的早、晚期镇痛作用无显著影响,而在末次HBO处理7天后进行侧脑室注射GABAB受体抑制剂,则引起了高压氧的晚期镇痛效应的显著下降,说明:(1)GABAA受体可能参与了单次HBO暴露诱导的镇痛效应;(2)GABAA受体和GABAB受体可能都没有参与反复HBO暴露诱导的早期镇痛效应;(3)GABAb B受体可能参与了反复HBO暴露诱导的晚期镇痛效应。此外,我们在单次HBO处理结束3小时后侧脑室注射5-HT1A受体阻断剂,发现其对单次HBO处理导致的镇痛效应没有影响。5-HT1A受体阻断剂对反复HBO处理导致的早期镇痛效应也没有显著影响,但在HBO处理结束7天后侧脑室注射5-HT1A受体阻断剂,其对反复HBO处理导致的晚期镇痛效应有显著的抑制作用。这些结果说明,5-HT1A受体没有参与单次HBO诱导的镇痛作用和反复HBO诱导的早期镇痛效应,但很可能参与了反复HBO诱导的晚期镇痛效应。在研究的第四部分,我们利用荧光法观察中脑导水管周围灰质(PAG)中神经元的数量,结果显示,反复HBO处理后的7天后,PAG中的5-HT1A受体阳性神经元显著增加,但在n NOS基因敲除小鼠中,PAG中的5-HT1A受体阳性神经元显著减少,表明n NOS对5-HT1A受体的调节作用。在GAD65基因敲除小鼠中,反复HBO处理后的7天后,PAG中的5-HT1A受体阳性神经元显著减少,表明GAD65对5-HT1A受体的调节作用。此外,在PAG中,我们没有观察到n NOS+神经元和5-HT1A受体阳性神经元有重合,但是观察到n NOS+神经元和GAD+神经元出现重合,表明n NOS和GAD之间可能直接存在互相作用。最后,Western Blot结果显示,反复HBO处理后的7天后,PAG中5-HT1A受体和GABAB受体的蛋白表达显著增高,但在n NOS基因敲除小鼠中,5-HT1A受体和GABAB受体的蛋白表达都受到了显著抑制。在GAD65基因敲除小鼠中,5-HT1A受体的蛋白表达受到了显著抑制。综上所述,本研究证明,单次高压氧导致的急性镇痛效应的机制涉及到n NOS和GABAA受体的激活,双相镇痛效应的早期效应的机制涉及到n NOS的激活,而晚期效应的机制涉及到发生在PAG中的n NOS与GABAB受体的相互作用以及5-HT1A受体的参与。和其他镇痛药物方式相比,高压氧有着不可替代的优势,费用较为低廉,无成瘾性、耐受性好,具有巨大的临床利用价值。本课题证实了高压氧的短效和长效镇痛效应,并从中枢镇痛机制探索其效应,为高压氧的临床应用提供理论依据。本研究首次选用HBO-n NOS-GABA-5-HTA1信号传导系统作为高压氧镇痛的内在机制进行研究,借此研究可能形成一个完整的思路探索高压氧的中枢镇痛机制,找出其镇痛机制的关键靶点,为开发镇痛药物提供新的策略。
第二部分:氢气对肺的氧化损伤的保护效应研究肺的氧化损伤是一种很常见的病理过程。很多因素,如过度吸氧、大气污染、吸烟、放射、重金属离子等等都可以造成肺的氧化损伤。需要长期吸氧的病人,一方面需要吸氧,一方面又面临着肺的氧化损伤的危险。这对矛盾常常难以解决,导致病人最后呼吸衰竭而死。另外,近来研究证明,大气污染和吸烟使肺组织直接暴露在有害因素中,引起肺脏严重的氧化损伤。放射引起的机体损伤也主要是氧化损伤,并且60%-70%的损伤是由羟自由基引起的。一些重金属离子如镉、铬和汞等也可以引起肺的氧化损伤。肺的氧化损伤非常常见,因此,如果能找到一种安全、有效的药物来防治肺的氧化损伤,对人类健康具有重大意义。在医学领域中,氢气的应用长久以来仅限于呼吸氢氧混合气进行大深度潜水,一般认为它不会和体内物质发生反应。1975年,Malcolm Dole等人首次报道,高压氢气(8 ATA)可能可以通过清除羟自由基治疗癌症。2001年,Bouchra Gharib等人发现高压氢气(8 ATA)有对抗寄生虫引起的肝炎作用,其机制也和清除羟自由基有关。但如此高压的氢气在临床上难以应用,因此他们的研究并没有引起广泛的关注。直到2007年,Ikuroh Ohsawa等人首次发现,普通压力的氢气也能发挥抗氧化作用,并且其机制为选择性清除毒性氧自由基,氢气的抗氧化作用才得以被广泛关注。随后,有人又证明呼吸2%的氢气可治疗肝和心肌缺血再灌注损伤、小肠移植引起的炎症损伤、新生儿脑缺血缺氧损伤等。此外,饮用饱和氢气水可治疗应激引起的神经损伤、人类II型糖尿病、化疗药顺铂引起的肾损伤和帕金森病,改善新生儿脑缺血缺氧损伤后神经功能和学习记忆能力等等。这些研究表明,氢气能够减轻氧化损伤。肺的氧化损伤的机理还不是很清楚,但是有很多研究表明它和超氧阴离子、过氧化氢和羟自由基密切相关。既然氢气可以通过选择性清除氧自由基发挥抗氧化作用,那么它对肺的氧化损伤有没有疗效呢?我们教研室的前期研究证明氢气可以减轻高压氧导致的成年大鼠的肺损伤。但是,高压氧只是众多造成肺的氧化损伤的因素的一种,且这种因素并不常见。因此,我们通过构建从动物到细胞的两种不同的肺的氧化损伤模型,通过不同方式给予氢气处理,来观察它对肺的氧化损伤的效应。实验第一部分,我们采用腹腔注射百草枯造成大鼠肺的氧化损伤模型,并通过口服给予大鼠饱和含氢水治疗。百草枯进入机体后主要聚集于肺部,经过单电子还原形成自由基,然后与分子氧反应生成联吡啶阳离子和超氧阴离子,后者歧化形成H2O2,再在Fe2+存在下形成羟自由基,引发链式脂质过氧化反应损伤细胞膜,使膜受体、膜蛋白酶和离子通道的脂质微环境改变,引起肺组织的氧化损伤。研究结果发现,口服给予饱和含氢水显著减少大鼠的胸腔积液、肺湿干比重、支气管肺泡灌洗液中的蛋白质含量和总细胞计数、乳酸脱氢酶,以及肺组织中的MDA含量。苏木精伊红(H&E)和TUNEL染色显示氢水组的肺组织损伤和细胞凋亡显著减轻。所有这些结果表明,口服含氢水可以抑制肺的氧化损伤,改善百草枯中毒引起的肺生化和组织学改变。实验第二部分,我们用H2O2造成更具代表性的氧化损伤,通过细胞实验研究氢气能否减轻Ⅱ型肺泡上皮细胞的氧化损伤。给予细胞H2O2处理后,细胞的死亡率显著上升,氧化损伤产物MDA和8-OHd G明显升高,细胞的抗氧化酶SOD和GSH水平显著降低,显示细胞的抗氧化能力下降。而给予氢气处理后,氢气可以有效降低A549细胞受到氧化损伤后的坏死率,有效抑制A549细胞氧化损伤后MDA、8-OHd G的升高和SOD、GSH的下降。
所有这些结果表明,含氢培养基可以提高Ⅱ型肺泡上皮细胞的抗氧化能力,抑制H2O2造成的细胞氧化损伤。