氢气对脓毒症的保护效应及机制研究

脓毒症(sepsis)是一种由感染因素诱发的、以全身炎症反应为主的综合征,是危重病患者的主要死因之一[1,2]。目前尚无对其有效的防治措施!大量研究表明炎症反应和氧化应激在脓毒症的发病过程中具有重要作用。2007年有日本学者在《Nature Medicine》报道了低浓度氢气(<4%)的选择性抗氧化作用及其对局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用。此外,近年来越来越多的学者认为氢气可做为一种新型的医学气体分子[4-6],本课题利用不同脓毒症动物模型,观察氢气对脓毒症及相关器官损伤的保护作用,并探讨其分子机制。


实验一：氢气吸入对中度和重度脓毒症小鼠的保护作用及机制 目的：氧化应激在脓毒症的病理生理过程中具有重要作用,氢气具有选择性抗氧化作用,本实验拟探讨不同浓度氢气吸入治疗脓毒症的最佳方案及相关机制。 方法：利用盲肠结扎穿刺法诱导中度和重度脓毒症小鼠模型,于模型后1h和6h分别给予不同浓度(0%、1%、2%、4%)和不同时长(0min、30min、60min、90min)氢气吸入,检测治疗过程中动脉血气,并观察动物于模型后不同时间点的存活率；在此基础上,选择最佳吸入方案,观察氢气对脓毒症器官损伤(肺、肝、肾)的保护作用,同时检测不同时间点血清和组织(肺、肝、肾)中促炎细胞因子(HMGB1、抗氧化酶(SOD、CAT)、氧化产物(8-iso-PGF2a)等变化情况；检测不同组织中Nrf2表达水平,进一步利用Nrf2基因敲除小鼠,观察氢气吸入治疗对于重度脓毒症动物存活率的影响。 结果：1.氢气吸入可有效提高中度和重度脓毒症小鼠的存活率,具有浓度和时间依赖性,最佳治疗方案为模型后1h和6h分别吸入2%氢气60min；2.氢气吸入明显减轻中度和重度脓毒症小鼠的器官损伤(肺、肝、肾),包括减轻组织病理损伤和评分,减少肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性、肺湿/干重比率、支气管肺泡灌洗液中蛋白含量,改善肝肾功能(ALT、AST、BUN、Cr);3.氢气吸入对脓毒症的保护作用与降低血清和组织中促炎细胞因子HMGB1水平和氧化产物8-iso-PGF2a含量,以及提高抗氧化酶SOD和CAT活性有关；4.氢气吸入可显著提高脓毒症动物器官组织(肺、肝、肾)中Nrf2表达,而氢气对Nrf2基因敲除动物无明显保护作用。 结论：氢气吸入可有效改善中度和重度脓毒症小鼠的存活率和器官损伤,降低脓毒症动物血清和组织中炎症反应和氧化损伤,机制与激活Nrf2信号通路有关。 实验二：氢气和高氧联合吸入对中度和重度脓毒症小鼠的协同保护作用及机制 目的：大量基础研究认为高氧对脓毒症具有保护作用,而高氧可能通过诱导氧自由基产生而加重脓毒症器官损伤或减弱高氧的治疗效果；低浓度氢气吸入具有抗氧化作用。本实验拟探讨氢气和高氧联合吸入对脓毒症是否具有协同保护作用及相关机制。 方法：利用盲肠结扎穿刺法诱导中度和重度脓毒症小鼠模型,于模型后1h和6h分别给予2%氢气或/和98%氧气吸入3h,观察动物于模型后不同时间点的存活率,并检测脓毒症器官(肺、肝、肾)损伤情况；在此基础上,观察氢气和高氧联合吸入后不同时间点血清和组织(肺、肝、肾)中促炎细胞因子(HMGB1、 TNF-α)、抗炎细胞因子(IL-10)、抗氧化酶(SOD、CAT)以及氧化产物(8-iso-PGF2a)等的变化情况。 结果：1.2%氢气或98%氧气吸入3h均可提高中度和重度脓毒症小鼠的存活率,而氢气和高氧联合吸入可以更有效提高动物的存活率,具有显著的协同效应； 2.2%氢气或98%氧气吸入3h明显减轻中度和重度脓毒症小鼠的器官损伤(肺、肝、肾),包括减轻组织病理损伤和评分,减少肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性、肺湿/干重比率、支气管肺泡灌洗液中蛋白含量,改善肝肾功能(ALT、AST、 BUN、Cr)和肺功能(PaO2/FiO2),而氢气和高氧联合吸入具有协同保护效应； 3.氢气和高氧联合吸入对脓毒症的保护作用与降低血清和组织中促炎细胞因子HMGB1和TNF-α水平和氧化产物8-iso-PGF2α含量,以及提高抗炎细胞因子IL-10水平和抗氧化酶SOD和CAT活性有关。 结论：氢气和高氧联合吸入对中度和重度脓毒症小鼠的存活率和器官损伤具有协同保护作用,其机制可能与调控炎症反应和氧化应激有关。 实验三：氢气对脂多糖诱导急性肺损伤小鼠模型的保护作用及机制 目的：急性肺损伤是危重病人的常见并发症,我们发现低浓度氢气吸入具有肺保护作用,然而具体机制仍不清。本实验拟利用脂多糖(LPS)诱导的急性肺损伤模型探讨氢气治疗急性肺损伤的相关机制,并进一步观察富氢盐水(一种溶解氢气至饱和状态的生理盐水)对急性肺损伤的保护作用。 方法：利用气管内给予脂多糖诱导急性肺损伤小鼠模型,于模型后1h和6h分别给予2%氢气吸入60min,观察肺损伤的相关指标和肺组织细胞凋亡情况,检测不同时间点支气管肺泡灌洗液中促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、HMGB1)和趋化因子(KC、MIP-1α、MIP-2、MCP1)水平以及肺组织NF-κB活性的变化,并进一步观察腹腔注射富氢盐水对急性肺损伤的保护作用。 结果：1.氢气吸入明显减轻脂多糖诱导的急性肺损伤,包括减轻肺组织病理损伤和评分,减少肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性、肺湿/干重比率、支气管肺泡灌洗液中蛋白含量,改善肺功能(PaO2/FiO2);2.氢气吸入减少脂多糖诱导的肺组织细胞凋亡,包括降低TUNEL染色阳性细胞和Caspase-3活性；3.氢气吸入抑制脂多糖诱导的肺炎症反应,包括减少支气管肺泡灌洗液中多形核粒细胞和总细胞的数量,以及促炎细胞因子(TNF-α、IL-1β、 IL-6、HMGB1)和趋化因子(KC、MIP-1α、MIP-2、MCP1)水平；4.氢气吸入降低脂多糖诱导的肺组织NF-κB活性,与调控炎症反应有关；5.富氢盐水腹腔注射对脂多糖诱导的肺损伤同样具有保护作用。
结论：氢气可有效改善脂多糖诱导的急性肺损伤,与调控NF-κB介导的炎症反应和细胞凋亡有关；富氢盐水对急性肺损伤也具有保护作用。 实验四：富氢盐水对脓毒症休克大鼠模型的保护作用及机制 目的：富氢盐水是一种溶解氢气至饱和状态的生理盐水,脓毒症休克是伴有低血压和循环衰竭的重度脓毒症。本实验拟探讨富氢盐水对脓毒症休克的治疗效果及相关机制。 方法：利用盲肠结扎穿刺法诱导脓毒症休克大鼠模型,于模型后1h静脉给予不同剂量的富氢盐水(5mL/kg、10mL/kg),检测不同时间点血气、血流动力学、器官(心、肺、肝、肾)功能和动物存活率；在此基础上,测定血清中不同时间点炎症因子(IL-1β、IL-6、HMGB1、NO)水平,以及器官组织(心、肺、肝、肾)中髓过氧化物酶(MPO)活性和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平。
结果：1.富氢盐水可明显提高脓毒症休克大鼠的平均动脉压(MAP)和血管反应性,改善血流动力学；2.富氢盐水可有效改善脓毒症休克大鼠的动脉血气指标和肺脏功能(PaO2/FiO2),降低乳酸水平；3.富氢盐水显著改善脓毒症休克大鼠心脏功能(EF、FS、SV、CO)、肝脏功能(ALT、AST、TP、ALB)和肾脏功能(BUN. Cr),发挥器官保护作用：4.富氢盐水明显降低脓毒症休克大鼠血清炎症因子(IL-1β、IL-6、HMGB1、NO)水平,减少器官组织(心、肺、肝、肾)中髓过氧化物酶(MPO)活性,发挥抗炎作用；5.富氢盐水可明显减少脓毒症休克大鼠器官组织(心、肺、肝、肾)中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平。 结论：富氢盐水治疗可有效改善脓毒症休克大鼠血流动力学、血管反应性和器官功能,其机制可能与降低炎症反应和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达水平有关。 小结 1.氢气吸入可有效改善中度和重度脓毒症小鼠的存活率和器官功能,其机制与激活Nrf2信号通路,调控炎症反应和氧化应激有关； 2.氢气和高氧联合吸入对中度和重度脓毒症小鼠的存活率和器官功能具有协同保护作用,机制可能与调控炎症反应和氧化应激有关； 3.氢气吸入可有效改善脂多糖诱导的急性肺损伤,与调控NF-κB介导的炎症反应和细胞凋亡有关； 4.富氢盐水对脂多糖诱导的急性肺损伤具有保护作用； 5.富氢盐水可有效改善脓毒症休克大鼠的血流动力学、血管反应性和器官功能,其机制可能与调控炎症反应和一氧化氮(NO)产生有关。 6.氢气和富氢盐水在对上述脓毒症模型的治疗过程中均未发现毒副作用,为其临床应用提供了理论依据和实验基础。