蛋白质是构成生命的物质基础,机体组织和细胞中所有重要的组成部分都有蛋白质的存在。蛋白质在体内水解成氨基酸被吸收利用,氨基酸经过脱氨基作用产生氨。此外,肠道微生物代谢也可以造成氨的释放,后者对于机体健康具有毒性。正常生理状态下,氨的生成与分解维持着动态平衡。肝脏通过鸟氨酸循环将氨形成尿素后再经肾脏排出体外。当肝脏出现功能异常时,过量的氨就会聚积在体内引发高血氨,进而引起一系列的病态反应。氨中毒学说被认为是临床上肝性脑病(Hepatic encephalopathy,HE)的主要发病机制。肝性脑病是由于肝功能严重障碍或门-体分流引起的以代谢紊乱为基础、轻重程度不同的神经精神异常综合征。目前的理论认为,肝性脑病的发生与氨在体内引起的氧化应激密切相关。研究表明,氢气在多种疾病模型及临床疾病治疗中都表现出了良好的改善效果,氢气在体内选择性地清除羟自由基和亚硝酸阴离子,是一种新型的外源性抗氧化剂;同时,氢气还表现出抗炎、抗细胞凋亡和抗代谢异常等良好的生物学效应。氢气的主要使用方法包括吸入氢气、饮用富氢水和注射富氢生理盐水等。
本研究主要从富氢溶液的制备及氢气在体内的生物学效应方面展开详细研究,期望能够从抗氧化应激角度进一步确认氢气的生物医学效应,主要研究内容如下:一、富氢溶液的制备及影响因素研究目的:检测铵盐溶液对氢棒产氢的催化效果,并分析溶液中的含氢量与含氧量、氧化还原电位、pH等之间的相互关系。
方法:将氢棒分别放置于不同浓度的氯化铵、硫酸铵、碳酸铵、碳酸氢铵、碳酸氢钠和亚硫酸钠等溶液的PET瓶中,置于40℃水浴锅分别反应0、2、4、6、8和10h,反应结束后立即检测溶液中的含氢量、含氧量、氧化还原电位和pH值。结果:溶液中含氢量随反应时间和铵盐溶液浓度的增大呈递增趋势,含氧量和氧化还原电位随着含氢量的增加呈递减趋势,且溶液中的含氢量与含氧量显著负相关(r=-0.9818);溶液的pH随着含氢量的增加呈递增趋势。结论:铵盐对氢棒与水的反应具有良好的催化作用,氯化铵催化作用最强,硫酸铵次之,碳酸铵、碳酸氢铵较弱。本研究为氢棒在不同溶液中制氢能力提供了详实的基础数据,为深入研究不同浓度的富氢溶液的功能及作用奠定基础。二、秀丽线虫氯化铵损伤模型的建立目的:以秀丽线虫为模式生物,建立稳定的氯化铵损伤模型。方法:在检测氯化铵半数致死浓度(LC50)的基础上,采用不同浓度氯化铵溶液(10mM、100mM、1000mM)对L3期秀丽线虫处理24h,检测秀丽线虫的生理水平、运动行为水平和生化水平指标的变化,观察氯化铵引起的毒性作用并分析其毒性作用机制。
结果:与对照组相比,氯化铵处理后的各组线虫在生理水平上,寿命显著缩短(p<0.05);体长显著缩短(p<0.01);产卵总量显著降低(p<0.01)。在运动行为水平上,氯化铵处理后的各组线虫局部运动能力显著下降,表现为线虫单位时间内的头部摆动次数、身体弯曲次数和咽泵震动次数显著下降(p<0.05)。在生化水平上,氯化铵处理后的各组线虫体内活性氧(Reactive oxygen species,ROS)含量显著上升(p<0.01),线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)显著下降(p<0.01),超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)活性显著下降(p<0.01),丙二醛(Malonaldehyde,MDA)含量显著上升(p<0.01)。氯化铵对线虫的损伤呈现浓度依赖的效应关系。结论:氯化铵对线虫生理水平、运动行为水平毒性作用显著,其毒性作用的产生与生成过多ROS引起氧化应激、影响抗氧化酶活性有关,为后续实验提供了稳定的生物学模型。三、氢气对氯化铵损伤秀丽线虫的效应研究目的:利用秀丽线虫氯化铵损伤模型,探究氢气的生物学效应及机制。方法:氢气组线虫自同步化后,连续10天每天在氢气环境下培养8h,同前采用亚致死浓度氯化铵溶液对L3期秀丽线虫处理24h,设置低浓度(10mM)、中浓度(100mM)氯化铵处理组和氢气环境培养的低、中浓度氯化铵处理组,同时设置正常组和氢气环境培养正常线虫,取10日龄线虫检测生理水平、运动行为水平和生化及分子水平指标的变化,同时检测10mM氯化铵处理组、氢气环境培养的10mM氯化铵处理组、正常组和氢气环境培养的正常组线虫肠道菌群的变化,分析氢气的生物学效应及机制。结果:与氯化铵处理组相比,氢气环境培养的氯化铵处理后的线虫体长显著增加(p<0.05);产卵总量显著增加(p<0.05);最大寿命及平均寿命出现延长趋势(p>0.05)。在运动行为水平上,与氯化铵处理组相比,氢气环境培养的氯化铵处理后的线虫单位时间内的头部摆动次数、身体弯曲次数和咽泵震动次数显著上升(p<0.05)。在生化及分子水平上,与氯化铵处理组相比,氢气环境培养的氯化铵处理后的线虫体内ROS含量显著下降(p<0.05),线粒体膜电位显著上升(p<0.05),SOD、CAT酶活性显著上升(p<0.05),MDA含量显著下降(p<0.05),线粒体DNA(Mitochondrial DNA,mtDNA)拷贝数显著上升(p<0.05),细胞凋亡水平显著下降(p<0.05),线虫age-1基因、hsp16.2基因、skn-1基因和ape-1基因表达量显著下降(p<0.05)。对线虫肠道微生物的检测分为4组,分别是正常组、氢气环境培养的正常组、10mM氯化铵处理组和氢气环境培养的10mM氯化铵处理组,四组之间Chao1指数和Observed species指数无显著性差异(p>0.05);在β多样性指数方面,通过LEfSe分析得到四组之间存在具有统计学差异的生物标识,其中,正常组的特异物种为α-变形菌纲、解糖假苍白杆菌属的解糖假苍白杆菌、根瘤菌目的根瘤菌科,氢气环境培养的正常组的特异物种为乳酸菌属的乳酸菌,10mM氯化铵处理组的特异物种为γ-变形菌纲,氢气环境培养的10mM氯化铵处理组的特异物种为假单胞菌目、假单胞菌科、假单胞菌属的假单胞菌。氢气环境培养的正常组和正常组相比,在门水平上,Proteobacteria、Firmicutes丰度无显著性差异(p>0.05),Bacteroidetes丰度显著性降低(p=0.001),Actinobacteria丰度显著性升高(p=0.006);在属水平上,Pseudochrobactrum、Pseudomonas、Ochrobactrum、Stenotrophomonas丰度显著性降低(p=0.001),Brevundimonas、Microbacterium丰度显著性升高(p=0.001)。氢气环境培养的10mM氯化铵处理组和10mM氯化铵处理组相比,在门属水平上,Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes丰度无显著性差异(p>0.05),Bacteroidetes丰度显著性降低(p=0.001);在属水平上,Pseudochrobactrum、Microbacterium丰度显著性升高(p=0.001);Pseudomonas、Ochrobactrum丰度无显著性差异(p>0.05),Stenotrophomonas、Brevundimonas丰度显著性下降(p=0.001)。
结论:氢气环境培养可减少氯化铵对线虫产生的毒性作用,氢气的生物学效应与清除ROS、促进抗氧化酶的活性、对线粒体损伤的保护作用和下调衰老、抗氧化及凋亡等基因表达水平有关。
引用：]卢宁.富氢溶液的制备及氢气对氯化铵损伤秀丽线虫的效应研究[D].安徽医科大学[2024-06-11].
