摘要：目的:探究氢气联合巨噬细胞对乳腺癌细胞生长的影响及其机制。方法:CCK8法和流式细胞术检测癌细胞的活力及凋亡情况,ELISA检测巨噬细胞分泌的细胞因子TNF-α,IFN-γ,IL-10,Western blot检测FADD、TRAF2、caspase3的表达,流式细胞术和RT-PCR分析各组巨噬细胞标志物CCR7、CD206的表达情况。结果:氢气联合巨噬细胞使乳腺癌细胞活力降低,凋亡增加;机制方面,氢气联合巨噬细胞增加了细胞因子TNF-α,IFN-γ的分泌,上调了凋亡通路中FADD、caspase3的表达,并且促进巨噬细胞向M1极化,抑制其向M2极化。结论:氢气联合巨噬细胞能抑制乳腺癌细胞生长。
乳腺癌是全球女性癌症发病率最高的疾病，也是国内外女性癌症相关死亡的首要原因，且近年来发病逐渐呈现低龄化趋势。氢气( H2 ) 是一种可以从水中电离获得的气体，一直未曾在生物医学领域得到应用。直到 2007 年，日本学者 Ohsawa 等报道，吸入 2% 的氢气可明显改善动物脑缺血再灌注损伤。随后，氢气在癌症改善中的作用也得到了人们的关注。巨噬细胞( m) 是固有免疫的重要组成部分，分布广泛，可塑性极强，在不同的刺激因素下可分化为激活免疫、抵御感染、抑制肿瘤发生的经典活化( M1) 型巨噬细胞，和免疫抑制、化疗耐药、促进肿瘤发展的交替活化( M2) 型巨噬细胞。本实验探究氢气联合巨噬细胞对乳腺癌细胞生长产生的作用及可能机制，为今后的临床研究提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 巨噬细胞的分离及乳腺癌MCF-7细胞培养
1.2.2 CCK8法分析乳腺癌MCF-7细胞活性
1.2.3 流式细胞术分析乳腺癌MCF-7细胞凋亡情况
1.2.4 ELISA检测巨噬细胞分泌的细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-10
1.2.5 Western blot检测FADD、TRAF2、caspase3的表达
1.2.6 流式细胞术分析各组巨噬细胞标志物CCR7、CD206的表达情况
1.2.7 RT-PCR分析各组巨噬细胞标志物CCR7、CD206的基因表达情况
3 讨论
乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤，也是导致女性癌症死亡的首要原因，尽管国内外学者已在乳腺癌的早期诊断与改善中做了很多的努力，但仍有些生物分子分型较差的乳腺癌表现出极具侵袭性的生物学行为，导致较差的预后，因此还需进一步地探寻其防治方法。
氢元素是自然界基本化学元素之一，也是有机生命组成最多的元素，氢可以作为电子传递介质，参与生命能量转化。虽然氢元素是生命元素，但以往在生物研究中却较少涉及氢气，这是因为常温常压条件下，氢气的溶解度较低，不能被机体大量吸收利用。曾有学者报道，高压氢气连续吸入 2 周后，荷瘤动物的皮肤恶性肿瘤明显缩小，说明高压氢气可以有效改善皮肤恶性肿瘤，其机制可能为氢气的抗氧化作用。2007 年，Ohsawa 等报道氢气可显著改善动物脑缺血再灌注损伤后，对氢气的研究逐渐受到重视，涉及多个领域和疾病，如神经系统损伤、电离辐射损伤、化疗药物引起的损伤、动脉粥样硬化、失血性休克、呼吸系统恶性肿瘤、辅助放化疗等。
在本研究中，首先检测了氢气联合巨噬细胞对乳腺癌细胞 MCF- 7 生长的影响，可以看出通入氢气后癌细胞的活性降低，流式细胞术检测出凋亡率增高; 随后对其可能的机制进行了一系列的探究:
一方面，氢气通入后，巨噬细胞所分泌的具有抑制、杀伤肿瘤细胞作用的细胞因子 TNF - α、IFN - γ增加，具有免疫抑制作用的细胞因子 IL- 10 减少，说明氢气能激活巨噬细胞抗瘤效应，促进巨噬细胞的免疫应答;
另一方面，根据流式细胞术测出的结果，我们推测氢气的抗肿瘤作用可能与诱导细胞凋亡有关，为了验证这一推论，我们对细胞内凋亡通路中的几个关键蛋白的表达水平进行了检测，FADD 是死亡受体介导的凋亡途径的关键启动因子， caspase3 能逐步启动层层级联反应，最终导致细胞凋亡，通入氢气后，这两者蛋白表达量在 Western blot 实验中显示有所上升，因此，氢气在体外能够显著抑制 MCF- 7 细胞的增殖并诱导细胞凋亡，其作用可能与上调 FADD，caspase3 蛋白的表达有关;
最后，我们还通过流式细胞术和 RT - PCR 检测了共培养体系中巨噬细胞的极化情况，巨噬细胞在外界刺激下可极化为 M1 和 M2 型，M1 型可抑制肿瘤发生，其标志 物 为 CCR7; M2 型可促进肿瘤生长，其 标 志 物 为CD206; 流式实验结果显示通入氢气培养后，CCR7 分子表达增加，CD206 分子表达下降，RT-PCR 实验结果显示二者基因表达也有相同改变趋势，因此，氢气联合巨噬细胞能抑制乳腺癌 MCF-7 细胞生长与氢气能促进巨噬细胞 M1极化，抑制巨噬细胞 M2 极化有关。
参考
李佳蔚，师建国. 氢气联合巨噬细胞对乳腺癌细胞生长的影响[J]. 现代肿瘤医学. 2020(23) :4036-4041
