目的:探讨氢气（H2）通过提高过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活剂1α（PGC-1α）的表达保护线粒体功能改善心肌缺血再灌注损伤。心肌梗死（MI）是由于严重和持续的心肌缺血引起的不可逆心肌细胞损伤,通常由于心脏冠状动脉粥样斑块破裂或侵蚀而发生,从而引发冠状动脉内血栓形成引起闭塞。MI进一步引起心力衰竭是导致患者死亡的主要原因。从MI中挽救缺血心肌的唯一方法是及时再灌注治疗。然而,心肌再灌注的同时也会加重心肌损伤,这种现象称为心肌缺血再灌注损伤（MIRI）。拟研究H2的应用以依赖于PGC-1α的方式减轻心肌细胞凋亡,改善心肌炎症反应和氧化应激,激活线粒体融合并抑制线粒体分裂来减轻MIRI。 方法:通过蛋白免疫印迹法（Western Blot）检测凋亡标志物（Bax、Cleaved Caspase-3、Bcl2）、炎症因子（IL-1β、TNF-α）、线粒体裂变（DRP1、MFF）和线粒体融合（MFN1、MFN2、OPA1）相关蛋白的表达水平。HE染色观察H2对缺血再灌注（I/R）损伤心肌组织结构的影响。透射电子显微镜（TEM）下观察心肌组织I/R损伤后线粒体结构的改变。实时荧光定量PCR（q PCR）检测I/R损伤以及I/R损伤经H2治疗后大鼠心肌组织PGC-1α的表达。TUNEL测定法观察H9C2细胞的死亡率,CCK8法测定细胞活力。流式细胞术测定（ROS）反应H9C2细胞氧化应激水平。免疫荧光法检测促凋亡因子细胞色素C（Cyt-c）释放水平。
结果:通过Western Blot检测凋亡标志物Bax、Cleaved Caspase-3及Bcl2的表达水平发现,发现MIRI后促进凋亡标志物Bax、Cleaved Caspase-3的表达升高,抑制凋亡标志物Bcl2的表达下降,而H2的使用可逆转以上结果。HE染色观察到H2可改善I/R损伤对心肌组织结构的影响。TEM观察到心肌组织在I/R损伤后线粒体结构的改变可被H2逆转。以上实验可证明H2对MIRI具有治疗效果。q PCR检测发现I/R损伤可刺激大鼠心肌组织PGC-1α的表达,而H2的使用使PGC-1α表达水平进一步升高。TUNEL测定法观察H9C2细胞的死亡率,我们发现经历HR损伤后,H9C2细胞死亡率超过80%,H2的治疗可明显降低细胞死亡率,而PGC-1α的缺失可重新激活死亡。通过CCK8法测定细胞活力发现H9C2细胞活力因HR损伤而明显降低,在H2干预后恢复到接近正常水平,并且H2的保护作用在PGC-1α缺失的细胞中被消除。此外,通过Western Blot检测发现HR损伤升高了促凋亡标志物Bax、Cleaved Caspase-3的表达,而H2治疗以依赖于PGC-1α的方式阻止了Bax、Caspase-3的激活。HR损伤同时可降低抑制凋亡标志物Bcl2的表达,H2以依赖PGC-1α的方式重新激活Bcl2。继续使用Western Blot检测HR损伤后细胞炎症因子表达水平,发现IL-1β、TNF-α表达水平显著增加,而H2治疗有效抑制了炎症反应,这种效果是通过提高PGC-1α的表达实现的,PGC-1α的缺失可抑制H2的治疗效果。此外,通过流式细胞术测定ROS证明了HR损伤引起H9C2细胞发生氧化应激,并被H2逆转至接近正常水平。然而,当PGC-1α缺失时,H2的治疗未能减弱ROS产生。通过免疫荧光法检测促凋亡因子Cyt-c的释放水平,发现H9C2细胞经历HR损伤后,细胞质/细胞核中出现了更多的Cyt-c,H2的使用则有效抑制了Cyt-c的释放,而PGC-1α的缺失消除了H2的有益作用。随后,使用Western Blot检测了线粒体裂变和线粒体融合相关蛋白的表达,促裂变蛋白（DRP1、MFF）的表达在HR处理的心肌细胞中显著上调,而促融合因子（MFN1、MFN2、OPA1）的表达水平在HR损伤下显着下调,H2治疗增强了促融合蛋白表达的同时降低了促裂变蛋白的表达水平,PGC-1α的缺失消除了H2对线粒体融合和裂变的调节作用。
结论:H2的应用可减轻心肌I/R损伤;PGC-1α的缺失减弱H2对I/R心脏的保护作用;H2通过作用于PGC-1α改善HR损伤下的心肌细胞炎症反应和氧化应激;H2可发挥保护线粒体功能,这种作用在HR损伤的条件下被PGC-1α缺失消除。
