近些年,人类脊髓损伤发病率呈递增趋势,其严重致残性不言而喻。脊髓损伤可分为原发性损伤和继发性损伤两大类。后者是指在脊髓受外力作用后,损伤区域产生复杂的生理生化反应,损害周围正常脊髓组织,导致损伤区域变大。目前大多数脊髓损伤的研究关注于继发性脊髓损伤。脊髓损伤涉及的病理机制较多、治疗效果不理想,当前脊髓损伤的治疗主要从抗炎症反应、抗氧化应激、抗细胞凋亡等机制着手。氧化应激是继发性脊髓损伤中神经元坏死、凋亡,神经功能紊乱的重要因素。日本学者Ohsawa于2007年研究发现,氢气可以选择性清除羟基和过氧亚硝基阴离子,降低脑梗死面积,改善脑功能,这一发现引起人们对氢气的广泛研究。近些年,越来越多的实验研究发现氢分子在抗氧化应激损伤方面发挥作用。
氢气作为一种新的抗氧化剂,具有渗透性好、来源广泛等特点,因此本研究通过培养脊髓神经元细胞、制作神经元机械损伤模型,发现高浓度氢气在减轻氧化应激损伤、保护线粒体功能、抑制神经元细胞凋亡等方面发挥作用,有望为脊髓损伤提供治疗选择。第一部分:脊髓神经元细胞的分离、培养及鉴定此部分实验我们以出生四天的雌性小鼠为原料,采用差速贴壁法纯化和培养原代神经元细胞,采用脊髓神经元特异性染色(烯醇化酶染色)对神经元进行鉴定,免疫荧光显微镜下可见神经元成黄绿色,布满整个视野,神经元突起清晰。结果提示成功分离和培养小鼠脊髓神经元细胞。第二部分:不同浓度氢气对机械损伤性神经元的形态作用分析此部分实验我们研究三种不同浓度(50%、65%和75%)氢气对机械损伤性神经元形态的影响,采用神经元机械损伤模型,光镜结果见75%氢气组在给予氢气治疗后损伤区域脊髓神经元细胞有少量迁移,神经特异性烯醇化酶NSE免疫荧光染色结果见各组差异不明显,微丝微管的免疫荧光染色结果见75%氢气治疗组的细胞形态基本恢复均匀,细胞骨架伸展,提示浓度为75%的氢气较浓度为50%和65%的氢气在神经元机械损伤模型中更有利于神经元的迁移,维持神经元形态。第三部分:高浓度氢气对机械损伤性神经元的保护作用分析此部分实验我们研究浓度为75%的氢气对机械损伤性神经元的保护作用,采用超氧化物阴离子荧光探针检测术后各组神经元活性氧自由基含量;流式细胞仪和Tunel染色检测神经元的凋亡情况;酶联免疫吸附试验检测MDA和8-OhdG的含量、Western blot检测SOD1、SOD2、Nox2和Nox4的含量。结果显示脊髓神经元损伤后ROS、MDA、8-OhdG、Nox2和Nox4的含量增高,SOD1、SOD2含量降低;高浓度氢气治疗后ROS、MDA、8-Ohd G、Nox2和Nox4的含量降低,SOD1、SOD2含量升高;流式细胞仪和Tunel染色结果显示脊髓神经元损伤后神经元凋亡增多,高浓度氢气治疗后神经元细胞凋亡数降低,以上结果提示浓度为75%的氢气抑制Nox2和Nox4的表达,提高抗氧化酶SOD1、SOD2的表达,抑制ROS生成、减轻脂质过氧化、抑制神经元细胞凋亡。第四部分:高浓度氢对脊髓神经元线粒体的作用研究此部分实验我们研究浓度为75%的氢气对脊髓神经元线粒体的影响,观察术后各组神经元线粒体的超微结构、检测线粒体膜电位变化、神经元ATP含量、抗氧化酶、凋亡蛋白含量,结果显示神经元机械损伤后线粒体受损、膜电位降低、ATP含量降低,Bax和caspase 3表达上调、Bcl-2表达下调、抗氧化酶Prx III和Trx2含量降低,给予氢气治疗后受损线粒体有所恢复、膜电位和ATP含量提高、Bax和caspase3表达下调、Bcl-2表达上调、抗氧化酶PrxIII和Trx2含量提高,以上结果提示浓度为75%的氢气抗氧化损伤、抑制线粒体凋亡途径激活,保护线粒体功能、抑制神经元凋亡。
综上所述,高浓度氢气可上调神经元SOD1、SOD2、PrxIII和Trx2的表达,抑制Nox2和Nox4蛋白的表达,从而减少活性氧自由基ROS的生成,抑制Caspase3和Box的表达,抑制线粒体凋亡途径的激活,抑制神经元的凋亡。本项研究有望成为治疗脊髓损伤的另一可行选择。
