目的:观察富氢盐水对肠缺血再灌注大鼠肠黏膜组织病理学变化及凝血功能的影响;并探讨其发挥作用的相关机制。
方法:选择西南医科大学实验动物中心的SPF级成年雄性Sprague Dawley(SD)大鼠48只,体重范围在220-250g之间,随机分为假手术组(SHAM组)、肠缺血再灌注组(I/R组)和富氢盐水处理缺血再灌注组(I/R+H2组),每组各16只;大鼠肠缺血再灌注模型,通过使用无创动脉夹夹闭大鼠肠系膜上动脉90min后再灌注2h来建立;在再灌注前10min时经尾静脉注射生理盐水或富氢盐水,剂量均为10ml/kg。从每个组中随机选取8只大鼠,先经过腹主动脉取血3ml(中段血),通过全自动凝血仪检测凝血功能相关指标,包括PT(凝血酶原时间)、APTT(活化部分凝血活酶时间)、TT(凝血酶时间)、FIB(纤维蛋白原)、FDP(纤维蛋白原降解产物)、D-Di(D-二聚体)、PT-INR(国际标准化比值)。然后取1cm小肠组织(距回肠末端5cm处),经4%多聚甲醛固定后,进行苏木素-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色,用于观察小肠组织病理学形态改变,并进行Chiu’s病理学评分。另外,每组剩余的8只大鼠,均经过腹主动脉取血7ml,一部分血液标本静置2h后离心吸取上清液,通过ELISA法(酶联免疫吸附法)检测TNF-α(肿瘤坏死因子α)、IL-6(白介素-6)、TF(组织因子)的水平;另一部分血液标本用于分离其中的单个核细胞,然后提取单个核细胞的蛋白,再通过Western Blot(蛋白免疫印迹法)检测NF-κB蛋白的表达情况。使用SPSS17.0软件进行统计分析,多个样本均数之间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),两两比较采用最小显著性差异检验(least significant difference,LSD),P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1、与SHAM组比较,I/R组和I/R+H2组的肠黏膜Chiu’s评分明显升高,肠黏膜损伤严重,差异具有统计学意义(P<0.01);与I/R组比较,I/R+H2组肠黏膜Chiu’s评分降低,肠黏膜损伤相对较轻,差异具有统计学意义(P<0.01)。2、与SHAM组比较,I/R组和I/R+H2组的PT、APTT、TT、FDP、D-Di、PT-INR水平升高,FIB水平降低,差异具有统计学意义(P<0.01);与I/R组比较,I/R+H2组PT、APTT、TT、FDP、D-Di、PT-INR水平降低,差异具有统计学意义(P<0.01),FIB水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。3、与SHAM组比较,I/R组和I/R+H2组的TNF-α、IL-6、TF水平及单个核细胞NF-κB蛋白水平升高,差异具有统计学意义(P<0.01);与I/R组比较,I/R+H2组TNF-α、IL-6、TF水平及单个核细胞NF-κB蛋白表达水平降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。
结论:1、肠缺血再灌注损伤后出现凝血功能紊乱,血液呈高凝状态,TNF-α、IL-6和TF水平升高及NF-κB通路的激活可能是其关键所在;2、富氢盐水可减少炎症因子及组织因子的分泌释放,并可抑制NF-κB通路激活,从而改善凝血功能紊乱。
