研究目的探索一种新的给氢方法——尾静脉氢气注射的安全剂量并测量血液及肝组织中的氢浓度;探讨这种新的给氢方式对CCl4诱导的大鼠肝纤维化的治疗效果,并在此基础上研究其可能的机制,从而为氢气医学的进一步推广提供理论依据。
材料和方法第一部分:首先,以正常wistar大鼠为研究对象,采用急性毒理实验Bliss法,每组分别经尾静脉匀速注射不同剂量氢气,观察14天后大鼠的急性毒性指标(死亡和存活情况),根据最大非致死剂量LD0和绝对致死剂量LD100逐步确定尾静脉注射H2合适受试剂量范围并计算大鼠尾静脉注射氢气的半数致死量LD50;其次,根据亚急性毒理实验原理,将大鼠随机分为空白组、H2组和N2组,以氢气小于LD0的2 mL·kg-115s-1(即15秒内按照每公斤体重2毫升的剂量匀速注射,下同)为受试剂量,通过生物机能信息采集系统、血气分析仪及小动物超声系统测定亚急性毒性指标(心率和呼吸频率、平均肺动脉压、血气分析结果、三尖瓣区收缩期未反流及肺动脉收缩压)来评估2 mL·kg-115s-1尾静脉注射H2的安全性;最后,采用1 mL·kg-115s-1的剂量通过Clark型氢微传感器测量血液中的即刻氢浓度和肝组织中的动态氢浓度。
第二部分:建立wistar大鼠CCl4诱导的肝纤维化模型,分为对照组、治疗组和模型组,第4周开始,治疗组每日尾静脉注射氢气1 mL·kg-115s-1,对照组与模型组大鼠尾静脉注射相应体积的等渗生理盐水。治疗结束后检测血清肝功能指标(ALT、AST);肝组织的病理学观察:HE染色进行半定量观察肝细胞变性程度,Masson染色进行各组肝纤维化胶原半定量分析和肝纤维化分期Ishak评分,免疫组化法观察COL1 α 1在肝组织的表达。采用GSH/GSSG、SOD、MDA蛋白活性检测试剂盒检测三组大鼠肝脏组织内氧化应激损伤水平。实时定量PCR测定大鼠肝组织TGF β 1、Smad3、Smad7的mRNA表达平。Western Blot测定大鼠肝组织TGF β 1蛋白表达水平。
第三部分:采用来源于第二部分的空白组、模型组和氢气组大鼠肝组织样本进行基于QE的代谢组学分析。根据代谢组学的正离子差异代谢物的层次聚类分析线索,对三组样本的星状细胞的Vitamin A脂滴进行透射电镜的定性定位观察,并进一步用Western Blot测定三组大鼠肝组织自噬指标LC3B的表达水平。研究结果1.尾静脉注射氢气的 LD50为 5.81 mL·kg-115s-1(95%CI:5.28-6.26 mL·kg-1)。2 mL·kg-115s-1的氢气尾静脉注射剂量小于LD0。2.2 mL·kg-115s-1尾静脉注射剂量的亚急性终点指标监测结果表明,N2组的mPAP水平(P<0.01)、心率和呼吸频率(P<0.05)均显著增加,而H2组与对照组相比无统计学意义;血气分析结果N2组出现了明显的低氧血症、而H2组未出现。超高分辨率多模小动物超声光声成像系统结果显示,空白组及H2组在尾静脉注射后三尖瓣区收缩期未探及明显反流,CWD测量肺动脉收缩压无明显升高:N2组收缩期三尖瓣口出现明显的反流信号,同时,CWD测量显示三尖瓣口反流压差较静息状态下明显增加,提示存在肺动脉栓塞。3.1 mL·kg-1 15s-1的剂量氢气尾静脉注射后,在血液和肝脏中同时并且即刻检测到了氢浓度:即刻浓度结果是血液37.6±3.7μmol/L,肝组织24.3±2.0 μmol/L。肝脏中的氢浓度逐步上升,在20分钟左右达到峰值60.6±0.5 μ mol/L。1 mL·kg-115s-1的剂量尾静脉注射后氢气的半衰期是t1/2=0.6801 h=40.81 min。
4.光镜下显示,尾静脉氢气治疗组炎性细胞沉积减少,肝细胞变性、水肿及坏死减轻;纤维组织增生减轻,部分大鼠纤维间隔减少,尤其汇管-汇管桥接纤维化和汇管-中央桥接纤维化改善明显,胶原面积和Ishak评分氢气治疗组低于模型组(P<0.05)。氢气治疗组COL1α1阳性染色区域较模型组减少(P<0.05)。
5.与正常对照组相比,模型组抗氧化因子GSH、SOD蛋白活性低于正常组(P<0.01),脂质损伤的指标MDA的水平高于正常组(P<0.01);氢气治疗组肝脏组织内GSH的水平和SOD蛋白活性相对于模型组增加(P<0.05),MDA的水平相对于模型组降低(P<0.05)。
6.模型组大鼠肝组织TGF-β1及TGF-β 1相关信号传导因子Smad3的mRNA表达水平较对正常照组显著升高(P<0.01),而氢气治疗组肝组织TGF-β 1和Smad3的mRNA表达水平显著低于模型组(P<0.05);Smad7 mRNA检测,模型组低于正常组(P<0.01);氢气治疗组与模型组比较升高(P<0.05)。模型组大鼠肝组织TGF-β1蛋白表达显著高于对照组(P<0.01);而尾静脉注射氢气治疗组大鼠肝组织TGF-β 1蛋白表达受到抑制,显著低于模型组(P<0.05)。
7.正离子的差异代谢物的层次聚类分析结果表明,维生素A(Vitamin A)含量在CCl4诱导的肝纤维化模型组中下降,经尾静脉氢气注射治疗后有所恢复。
8.电镜观察肝组织星状细胞:相对空白组,模型组胞体增大、数量增多、维生素A脂滴减少。氢气尾静脉注射治疗组维生素A脂滴有所恢复。
9.模型组大鼠肝组织LC3BⅡ相对表达量显著高于对照组(P<0.01);而尾静脉注射氢气治疗组大鼠肝组织LC3BⅡ相对表达量受到抑制,显著低于模型组(P<0.05)。
研究结论一定剂量和一定注射速度下(如1 mL·kg-11 5s-1)大鼠尾静脉注射氢气是安全的,并且能迅速在体内达到常用的治疗浓度。用这种新的给氢方法能够减轻CCl4诱导的大鼠肝纤维化,其可能机制是通过降低大鼠CCl4诱导的氧化应激水平,从而有效抑制肝组织自噬,进而减少Vitamin A脂滴的丢失来调控TGF-β1、Smad3、Smad7的表达,最终维持星状细胞的稳态、减轻肝纤维化。这些结果表明,尾静脉注射氢气可以作为一种安全有效的治疗方法,可以为肝纤维化的治疗提供了新的科学依据。
