研究背景:脓毒症是全身炎症反应引起的综合征,脓毒症晚期全身多器官功能发生障碍常常危及生命健康。全世界范围内,脓毒症仍然有较高的发病率和病死率,并给社会带来巨大的负担。大脑是脓毒症易累及器官之一,脓毒症时脑损伤的严重程度与患者预后密切相关。因此,针对脓毒症相关性脑病的防治研究具有重要意义。线粒体是细胞能量和代谢的核心,通过氧化磷酸化为细胞正常生理活动提供能量。线粒体功能异常与脓毒症引起的器官功能障碍密切相关。改善脓毒症时细胞线粒体功能异常对脓毒症患者的预后及存活率具有重要意义。线粒体质量控制,包括线粒体生物合成、线粒体自噬、线粒体融合和分裂,在线粒体功能恢复中发挥重要作用。线粒体生物合成是产生新线粒体的过程,这些新生成的功能正常的线粒体通过融合和分裂形成线粒体网络,而发生损伤和功能异常的线粒体则通过线粒体自噬清除。自日本Ohsawa教授证明低浓度氢气（2%4%）具有抗氧化作用后,氢医学的研究成为一大热点。目前已证实氢气具有抗氧化、抗炎和抗凋亡等作用,而且对脓毒症器官功能障碍有一定的治疗作用。另外有研究证实,氢气可以通过改善线粒体功能,促进线粒体生物合成、线粒体自噬和线粒体分裂、抑制线粒体融合减轻脓毒症器官损伤[1-3]。本实验拟探讨氢气对脓毒症相关性脑病小鼠海马组织线粒体动力学和功能的影响,以及氢气调控线粒体生物合成的机制。第一部分:氢气调控线粒体动力学平衡和功能减轻脓毒症相关性脑病目的:探讨氢气对脓毒症相关性脑病小鼠海马组织线粒体功能和线粒体动力学的影响。
方法:健康雄性野生型C57BL/6J小鼠共计316只,周龄6-8周,体重20～25 g,随机分为4组（n=79）:假手术组（Sham组）,假手术+氢气组（Sham+H2组）,脓毒症组（CLP组）和脓毒症+氢气组（CLP+H2组）。采用盲肠结扎穿孔术（cecal ligation and puncture,CLP）制备小鼠脓毒症相关性脑病模型。手术后1 h和6 h,Sham+H2组和CLP+H2组小鼠吸入2%氢气1 h,其余两组吸入空气。造模后观察各组小鼠7 d生存情况。于手术后3 d、5 d和7 d进行Y-迷宫实验检测小鼠工作记忆能力。手术后24小时,Nissl染色观察脑组织病理改变,TUNEL染色观察凋亡情况,使用透射电镜观察线粒体形态,使用试剂盒检测脑组织炎症因子水平、线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential,MMP）、线粒体ATP含量、线粒体呼吸链复合物I活性和线粒体呼吸链复合物II活性,使用Western blot检测线粒体生物合成和线粒体融合/分裂相关蛋白的表达情况。
结果:氢气吸入明显提高脓毒症小鼠的7 d存活率（P<0.05）。Y-迷宫实验显示脓毒症时小鼠的自发交替百分比下降,而氢气治疗提高了小鼠的自发交替百分比（P<0.05）。Nissl染色、TUNEL凋亡和投射电镜显示脓毒症时小鼠神经元及海马组织线粒体损伤明显,神经元凋亡增加,氢气治疗减轻神经元和海马组织线粒体损伤,减少细胞凋亡。与Sham组相比,CLP组小鼠海马组织中TNF-α和IL-6升高（P<0.05）;与CLP组相比,CLP+H2组小鼠海马组织中TNF-α和IL-6下降（P<0.05）。与Sham组相比,CLP组小鼠海马组织MMP、ATP含量和线粒体呼吸链复合物I活性降低（P<0.05）;与CLP组相比,CLP+H2组小鼠海马组织MMP、ATP含量和线粒体呼吸链复合物I活性升高（P<0.05）。各组海马组织中线粒体呼吸链复合物II活性无差异（P>0.05）。与Sham组相比,CLP组小鼠海马组织线粒体生物合成相关蛋白（PGC-1α、NRF2、Tfam）表达增加（P<0.05）;与CLP组相比,CLP+H2组小鼠海马组织线粒体生物合成相关蛋白（PGC-1α、NRF2、Tfam）表达进一步增加（P<0.05）。与Sham组相比,CLP组小鼠海马组织Drp1表达增加（P<0.05）,Mfn2表达减少（P<0.05）;与CLP组相比,CLP+H2组小鼠海马组织Drp1表达减少（P<0.05）,Mfn2表达增加（P<0.05）。结论:氢气治疗提高脓毒症小鼠存活率,改善认知功能,减轻脓毒症引起的脑损伤,具有抗凋亡、抗炎作用。氢气对脓毒症相关性脑病的保护作用与其改善线粒体功能,调节线粒体生物合成和线粒体融合/分裂有关。第二部分:氢气激活PGC-1α促进线粒体生物合成减轻脓毒症相关性脑病目的:探讨氢气对脓毒症相关性脑病小鼠海马组织线粒体生物合成的影响及相关机制。
方法:健康雄性野生型C57BL/6J小鼠共计244只,周龄6-8周,体重20～25 g,随机分为4组（n=61）:脓毒症组（CLP组）,脓毒症+氢气组（CLP+H2组）,脓毒症+PGC-1α抑制剂组（CLP+SR-18292组）和脓毒症+PGC-1α抑制剂+氢气组（CLP+SR-18292+H2组）。采用盲肠结扎穿孔术（CLP）制备小鼠脓毒症相关性脑病模型。手术前3 d,CLP+SR-18292组和CLP+SR-18292+H2组小鼠每天腹腔注射PGC-1α抑制剂SR-18292（45 mg/kg）[4]。手术后1 h和6 h,CLP+H2组和CLP+SR-18292+H2组小鼠吸入2%氢气1 h,其余两组吸入空气。手术后24 h,使用Western blot检测线粒体生物合成相关蛋白的表达情况。造模后观察各组小鼠7 d生存情况。于手术后3 d和5 d进行Y-迷宫实验检测小鼠工作记忆能力。手术后24 h,TUNEL染色观察凋亡情况,使用试剂盒检测线粒体膜电位（MMP）、线粒体ATP含量、线粒体呼吸链复合物I活性。结果:与CLP组相比,CLP+H2组小鼠海马组织乙酰化PGC-1α表达减少,而NRF2和Tfam表达增加（P<0.05）;与CLP+H2组相比,CLP+SR-18292+H2组小鼠海马组织乙酰化PGC-1α表达增加,而NRF2和Tfam表达减少（P<0.05）。与CLP组相比,CLP+H2组小鼠的7 d存活率明显增加（P<0.05）;与CLP+H2组相比,CLP+SR-18292+H2组小鼠的7 d存活率明显下降（P<0.05）。Y-迷宫实验显示而氢气治疗提高了脓毒症小鼠的自发交替百分比,而使用PGC-1α抑制剂SR-18292逆转了氢气改善脓毒症小鼠工作记忆能力的作用（P<0.05）。TUNEL凋亡显示氢气治疗减少神经元细胞凋亡,而CLP+SR-18292+H2组小鼠海马组织神经元细胞凋亡明显增加。与CLP组相比,CLP+H2组小鼠海马组织MMP、ATP含量和线粒体呼吸链复合物I活性升高（P<0.05）;与CLP+H2组相比,CLP+SR-18292+H2组小鼠海马组织MMP、ATP含量和线粒体呼吸链复合物I活性下降（P<0.05）。
结论:氢气通过去乙酰化激活海马组织PGC-1α促进线粒体生物合成,改善线粒体功能,减轻脓毒症引起的脑损伤。
