氢气对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注后损伤的改善作用

桂林医学院研究生毕业论文，导师林高翔
 

随着近年来临床手术中冠脉溶栓术、经皮冠状动脉腔内成形术等微创手术的发展,术后早期并发症的防治成为时下研究的热点,而其中最常见、最严重的并发症一心肌缺血再灌注损伤越来越受到人们的关注。糖尿病是一种临床常见的慢性疾病, 流行病学和临床研究显示,糖尿病人群中缺血性心脏病的发生率及严重程度远高于非糖尿病人群。目前,人们将更多得将目光放在糖尿病对心肌缺血再灌注损伤的影响上。近年来大量研究表明,氢气是一种重要的生理性调节因子,在细胞和器官水平上,具有明确的选择性抗氧化、抗炎症和抗细胞凋亡等脏器保护作用,本研究复制糖尿病大鼠模型,观察氢气腹腔注射对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响,为糖尿病患者围术期处理提供理论依据。
 

第一部分氢气对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的影响。
 

 

目的:观察氢气对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡及凋亡相关蛋白表达的影响。方法:以链脲佐菌素复制糖尿病模型,造模成功后继续高糖喂养4周作心肌I/R损伤模型。60只成年雄性SD大鼠,体质量300—350 克,随机数字表法分非糖尿病假手术对照组(NS),非糖尿病I/I己组(NI瓜), 非糖尿病氢气改善组(NH),糖尿病假手术对照组(DS),糖尿病I/R组(DI/R),糖尿病氢气改善组(DH),每组10只。假手术组只穿线包绕冠状动脉左前降支不接扎,I/R组结扎冠状动脉左前降支30min后松开行再灌注 120min制备心肌I/R损伤模型。氢气改善组于再灌注同时腹腔注射99.6%浓度5ml/kg的氢气。再灌注120min后,采集动脉血利用分光光度计法测血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)活性,同时采用免疫组化法测定各组心肌细胞Bcl一2、Bax、Caspase3表达水平。原位末端标记 (n肥L)法检测心肌凋亡细胞并计算凋亡指数。结果:糖尿病大鼠心肌 I/R后血浆LDH、CK—MB水平明显高于非糖尿病大鼠(P<o.01),同时Bcl.2、 Bax、Caspase3蛋白的表达水平及凋亡细胞指数均明显增高(P<0.01),与I/R 组相比,氢气改善各组血浆LDH、CK-MB和凋亡细胞指数水平明显降低, Bcl.2蛋白表达的阳性细胞百分率明显升高(P<0.01),Bax、Caspase3蛋白阳性细胞百分率及凋亡细胞指数均明显降低(P<o.01)。结论:氢气腹腔注射对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用可能通过上调Bcl一2蛋白表达和下调Bax、Caspase.3蛋白表达进而抑制心肌细胞凋亡有关。
 

I/R组结扎冠状动脉左前降支30min后松开行再灌注 120min制备心肌I/R损伤模型。氢气改善组于再灌注同时腹腔注射99.6%浓度5ml/kg的氢气。再灌注120min后,采集动脉血利用分光光度计法测血清肌酸激酶同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)活性,同时采用免疫组化法测定各组心肌细胞Bcl一2、Bax、Caspase3表达水平。原位末端标记 (n肥L)法检测心肌凋亡细胞并计算凋亡指数。结果:糖尿病大鼠心肌I/R后血浆LDH、CK—MB水平明显高于非糖尿病大鼠(P<o.01),同时Bcl.2、Bax、Caspase3蛋白的表达水平及凋亡细胞指数均明显增高(P<0.01),与I/R 组相比,氢气改善各组血浆LDH、CK-MB和凋亡细胞指数水平明显降低, Bcl.2蛋白表达的阳性细胞百分率明显升高(P<0.01),Bax、Caspase3蛋白阳性细胞百分率及凋亡细胞指数均明显降低(P<o.01)。结论:氢气腹腔注射对糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用可能通过上调Bcl一2蛋白表达和下调Bax、Caspase.3蛋白表达进而抑制心肌细胞凋亡有关。
 

第二部分PI 3K/Akt信号通路在氢气抑制糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡中的作用。
 

目的:研究P13K/Akt信号通路与氢气抑制糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌细胞凋亡的关系。方法:以链脲佐菌素复制糖尿病模型,造模成功后继续高糖喂养4周作心肌I/I濒伤模型。50只SD大鼠进行糖尿病造模,造模成功40只,再根据“随机数字表法”分成4组,分别为糖尿病假手术组(DS 组)、糖尿病心肌缺血再灌注组(DI组)、糖尿病心肌缺血再灌注氢气改善组(DH组)、糖尿病心肌缺血再灌注氢气改善+LY294002组(DI+LY294002组),每组各10只。采用结扎大鼠心脏冠状动脉左前降支建造大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，再灌注时给予腹腔注射氢气，LY294002于注射氢气前经鼠尾静脉注入。免疫组化技术检测各组心肌细胞Bad表达水平,反转录.聚合酶链反应(RT—PCR)检测心肌细胞pAkt mRNA表达。结果:与DS组比较,DI/R组、DH组、DH+LY294002组的心肌组织Bad蛋白水平均升高(P<0.01);与DI/R组相比较,DH组心肌组织Bad蛋白水平降低 (P<0.01),而DH+LY294002组心肌组织Bad蛋白水平差异无显著性 (P>0.05);与DH组相比较,DH+LY294002组心肌组织Bad蛋白水平升高(P<O.01)。与DS组比较,DI/R组、DH组、DH+LY294002组心肌组织pAktmRNA 表达水平均增高(P<0.01);与DI/R组相比较,DH组心肌组织pAktmRNA 表达水平增高(P<0.01),而DH+LY294002组心肌组织Bad蛋白水平差异无显著性(P>0.05);与DH组相比较,DH+LY294002组心肌组织pAktmRNA 表达水平降低(P<o.01)。结论:氢气有效抑制糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤细胞凋亡的机制可能是通过激活P13K/Akt信号通路而实现的。