在肝脏切除过程，吸入氢气可防止肝脏缺血再灌注损伤
肝切除是一种手术过程，是肝衰竭的高风险因素，这可能是致命的。其中一个关键机制涉及缺血-再灌注损伤。众所周知，氢对减轻这种损伤具有积极作用，这项工作目的是证明在家猪肝脏切除过程中吸入氢对抗氧化、抗炎和抗凋亡的作用。
本研究共使用了12头家猪，6只动物在全麻时进行了吸入氢切除，6只动物在常规全麻下进行了相同的手术。术中准备肝门静脉左支、肝左动脉，并使用止血带。先诱导热缺血120分钟，然后再进行肝脏再灌注120分钟。然后从肝脏的缺血区和非缺血区取出样本进行组织学和生化检查。
组织学变化的评估是基于损伤的数值表达式基于Suzuki分数。与对照组相比，吸入氢气组的肝脏组织变化有统计学意义上的降低。生化指标在肝转氨酶、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LD)、乳酸方面无统计学差异。然而，一个令人惊讶的结果是-谷氨酰胺转移酶(GMT)的统计显著性差异。在血浆样品中，氧化损伤的标记水平变化明显。
本研究发现在大型动物猪肝脏切除过程中吸入氢气降低缺血-再灌注损伤相关氧化应激水平。组织学和机体氧化应激直接测定均证实了这一现象。
肝脏缺血再灌注损伤是肝功能障碍发生的重要机制之一，分初始和后期两个阶段。在再灌注最初2小时内，枯否氏细胞在缺血刺激下产生大量活性氧(ROS)，导致急性肝细胞损伤。再灌注后6小时开始晚期阶段，中性粒细胞在肝脏内积聚，这是众所周知的ROS来源细胞，可进一步加重肝脏损伤。这两种产生ROS的细胞都属于典型的炎症细胞。
肝细胞和血窦内皮细胞的线粒体呼吸链被破坏，导致缺血-再灌注肝损伤初始阶段ROS额外形成。此外，长时间肝缺血会加剧再灌注过程中氧化应激发展。因此，氧化应激引起的缺血再灌注损伤在实验室和临床研究中都相当受重视。
虽然造成缺血-再灌注损伤的原因是多因素的，包括缺氧、炎症反应、游离氧自由基损伤和ROS。
ROS既包括自由基，也包括非自由基的物质，因此，“活性氧”一词比“自由基”更准确。自由基是任何化学实体，原子、分子或离子，其外层电子壳层至少有一个不成对电子，使其具有高度化学活性，能够独立存在。
羟基自由基(HO•)是活性最强的活性氧自由基，因此毒性极强。它起源于过渡金属离子的存在(铁和铜离子),作为过氧化氢被还原的芬顿反应一个产物,或从超氧化物阴离子(O2•−)与过氧化氢反应Haber-Weiss反应产生。因为超氧化物阴离子和过氧化氢都能被天然抗氧化剂SOD、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶。然而，没有任何一种酶可以消除羟自由基。因此，寻找能选择性地与氢氧自由基发生反应的理想还原剂是极其重要的。
近年大量研究表明，氢气是一种很有前途的抗氧化剂。虽然氢作为一种气态元素已经有大约250年的研究历史，但它在体内和体外与ROS(羟基自由基- ho•)发生反应的能力直到2007年才被发现。
氢气是无色、无味、无嗅的，在与氧的混合物中极易爆炸。在大多数实验中，通常使用可燃烧最小浓度（4%）的一半(2%)。在人体内氢是完全惰性的，没有毒性作用，即使在数小时的暴露中也是如此。
由于氢气没有极性，它能很快穿透所有生物膜，包括亚细胞细胞器。这是它与其他抗氧化剂相比的巨大优势。在连续吸入2% 氢气混合,浓度大约8µM，于内部和细胞外液舱后约45分钟。这种浓度在整个吸入期间都保持不变。然后通过呼气排出氢，半衰期为8－10分钟。氢气吸入似乎是最合适的方法，因为吸入后可在生物体迅速饱和和易于维持稳定在某一浓度水平。
从外科手术角度来看，肝切除和肝移植保护作用尤为重要。肝切除术是一种高风险手术，容易伴有严重的并发症。最严重的是术后肝功能衰竭，可能是致命的。肝功能障碍的关键机制之一是缺血再灌注损伤。鉴于在过去10年的各种临床试验中有关氢的积极作用的信息，评估氢气在临床相关的半肝切除模型中的潜力是合理的，其积极作用可能是特别有利的。
在以前发表的研究中，大多数使用小型实验室动物，且只评估选定组织学和生化数据。到目前为止，还没有发表过使用大型实验动物进行肝脏缺血再灌注损伤用氢气改善的综合评价，这些研究可使用组织学和生化标志物，包括氧化应激标志物，这些标志物可用于在分子水平上评估氧化损伤的实验研究。
因此，本研究目的是通过组织学和生化检查以及氧化损伤标志物的检测，证实吸入氢对家猪大肝切除过程中抗氧化、抗炎和抗凋亡的积极作用。
本研究纳入12只实验动物(家猪)，随机分为两组，每组6只(氢气改善干预组和对照组)。动物平均体重为32.5±2.2 kg。经皮切口至门静脉左支止血带、左肝动脉止血带的平均手术时间为30±7.2分钟。
评估缺血-再灌注损伤引起的组织学变化的依据是窦道充血、空泡化(球囊变性)和肝细胞坏死的程度，然后根据Suzuki评分对损伤严重程度进行数值表达。采用“干预组”(n=6)与“对照组”(n=6)、“左(缺血性)叶”(n=6)与“右(非缺血性)叶”(n=6)进行双向方差分析(ANOVA)。干预组左叶平均得分为1.000±0.274(左×无氢)，对照组平均得分为1.667±0.274(左×无氢)，两组平均值相差66.7%。干预组右叶(非缺血区)Suzuki评分均值为0.167±0.274(右×无氢)，对照组为0.833±0.274(右×无氢)，平均差异为398%(见图1)。
图1
使用铃木评分与使用双向方差分析(ANOVA)比较肝损伤评分。左边，肝脏的左叶;肝脏的右叶;氢,干预组;没有氢，是对照组。
因此，使用氢气的干预组的肝脏样本与对照组相比，组织学变化有统计学意义(氢气对比对照组，P=0.024)。这些差异在非缺血性脑叶和缺血性脑叶(左×右，P=0.006)均可见。
生化检查显示的测量值没有统计上的重要区别。肝转氨酶(AST、ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LD)和乳酸(见表3),肌酸激酶值(包括亚型BB)似乎完全随机的非标准和统计,因此,我们未能确认Vaubourdolle等的发现。
然而，干预组和对照组之间的谷氨酰胺转移酶(GMT)差异有统计学意义(P<0.001)。其水平在手术过程中波动最小;而干预组的测量值平均比对照组高2.5倍(图3)。
采用单因素方差分析(ANOVA)比较对照组和干预组实验期间-谷氨酰胺转移酶(GMT)水平。
氧化损伤标记物
氧化损伤标志物水平差异显著，尤其在血浆样品中(见表4)。氢处理干预组MDA和3-NT水平明显低于对照组，表明氧化应激程度较低。相应地，谷胱甘肽和NP-SH水平显著升高，其氧化产物(非蛋白质二硫化物)水平显著降低。与肝脏非缺血叶(右侧)和缺血叶(左侧)相比，肝脏组织有显著性差异(见表5)。
表4血浆氧化损伤标志物
讨论
肝切除是一种高风险的手术，常伴有严重的并发症，术后肝功能衰竭是最严重的手术之一，极易致命。肝功能障碍发生的关键机制之一是缺血再灌注损伤。在这项实验研究中，我们在一个临床相关的肝缺血-再灌注损伤模型中，评估了吸入氢对家猪的抗氧化、抗炎和抗凋亡作用。通过组织学和生化检查(包括氧化损伤标记的检查)来评估这些影响。
吸入似乎是手术过程最适合的给氢气形式，因为它快速组织饱和和易于保持恒定水平。其他可能的给药方法包括静脉注射富氢生理盐水和饮用富氢饮用水。
2001年，发表了第一个关于高压下氢气对肝脏损伤的保护作用的研究。2007年进一步探讨了氢对肝脏缺血的改善作用。关于氢对肝脏组织影响的研究相对较新，肝病的研究方法和类型也有很大的差异。
在最早研究，Gharib等人研究了分子氢对患有慢性寄生虫性肝病小鼠模型的影响。小鼠在高压氧舱中呼吸氢气和氧气的混合物14天(87.5%的氢气，0.7MPa)。作者观察了肝功能、肝组织氧化损伤、肝纤维化和炎症症状，并得出结论，持续高剂量氢对肝功能有显著保护作用。这项研究首次证明了氢的抗炎和抗氧化作用。由于氢剂量如此之高，该研究在临床应用方面的可转化性有限。2007年，Ohsawa等人发表了另一项重要研究，表明同样抗氧化效果可以通过吸入2%氢35分钟来实现。因为2%这种浓度非常容易实现，这些发现具有更大临床潜力。Fukuda等人利用大鼠模型发表了一篇关于氢对缺血-再灌注肝损伤影响的研究。作者发现，根据组织学切片和丙二醛水平和肝脏测试，氢对缺血性肝损伤有显著的影响。2009年，Kajiya等人证明了氢对伴刀豆凝集素A型肝炎的保护作用。同年，Tsai等人发现富氢水对四氯化碳诱导的肝炎小鼠的肝脏组织有保护作用。孙汉勇等人证明，氢不仅可以保护肝脏免受损伤，还可以帮助预防三种不同的肝硬化模型。刘等研究发现，腹腔内应用富氢液体可提高肝脏抗氧化能力，减少炎症反应，具有重要的临床意义。目前的研究表明，长期饮用富氢水可以改善非酒精性脂肪性肝炎的症状，改善肝功能和肝脏形态(在预防纤维化方面)。在这项研究中，作者不仅证明了富氢水对改善肝功能的长期作用，而且还证明了它可以降低患恶性肿瘤的风险。这有力地证明了氢在预防癌症方面也有应用价值。Kang等人发现，每天使用富氢水可以改善接受肝肿瘤放疗的患者的生活质量。这种影响可以通过减少放疗引起的氧化应激和炎症反应来解释。另一项研究表明，氢对肥胖糖尿病患者具有预防肝脂肪纤维化和降低胰岛素抵抗的积极作用。2013年，Xia等人发表了一项研究结果，30名慢性乙型肝炎患者使用富氢水6周。与对照组相似的患者相比，这些患者的肝功能得到改善，循环HBV DNA水平降低。2015年，Zhang等人发表了一项研究结果，该研究观察了接受同基因原位肝移植的大鼠。在移植前，他们吸入1-3%的混合氢。吸入2%混合氢的大鼠表现出相当低的缺血-再灌注肝损伤。Lin等人在2017年发表了一项研究，证实了富氢水对乙醇诱导的氧化应激小鼠的抗氧化作用。小鼠肝脏功能改善，丙二醛水平降低，内在天然清道夫机制功能增强。最近，Uto等人在同基因原位肝移植前使用富含溶解氢的UW溶液储存肝脏。与对照组相比，肝脏移植显示出较低的氧化损伤和较低的凋亡肝细胞数目。最后，Ge等在小型猪腹腔镜肝切除术中显示了氢气的保护作用。手术后,动物表现出低水平的炎症标记物和皮质醇。
上述研究表明，氢在肝脏缺血、肝炎、脂肪变性和其他肝脏疾病中具有显著的抗氧化潜力。
缺血再灌注损伤后组织学变化的评估采用Suzuki评分进行半定量表达。干预组的肝脏样本，即与对照组相比，吸入氢气组组织学变化有统计学意义。此外，干预组非缺血性脑叶的组织学改变几乎可以忽略不计。结果表明，在组织学水平上，氢气使用显著降低了肝缺血再灌注损伤的程度。
生化检测结果显示肝转氨酶(AST、ALT)、ALP、LD、乳酸无统计学差异。虽然AST的围手术期水平升高，但升高可能是由于开腹手术中发生的肌肉组织损伤所致。两组间差异无统计学意义。肌酸激酶值(包括BB亚型)似乎完全随机，且无统计学意义。因此，我们未能证实Vaubourdolle等人的结论，从我们的结果来看，肌酸激酶BB不能作为判断肝缺血再灌注损伤程度的简单指标。同样，我们也未能证明常规肝功能检查可以作为肝缺血-再灌注损伤严重程度的指标。然而，一个令人惊讶的结果是-谷氨酰胺转移酶(GMT)水平在统计学上有显著差异。虽然在手术过程中水平波动很小，但干预组平均值是对照组的2.5倍。GMT值升高与ALP升高相结合，通常被认为是胆道损伤的一个标志。但本研究所有测量值均在生理范围内。因此，不同水平的GMT可能是由于氧化应激水平较高时GMT分子的氧化损伤，导致血液中GMT水平降低。因此，GMT水平可以作为术后早期缺血-再灌注损伤严重程度的预测因素。这一假设与Belcastro等人的一项研究一致，在该研究中，作者观察到GSH、NP-SH水平下降(参见氧化损伤标记物)，以及GMT活性随着氧化应激的增加而下降3.5倍的现象，正如我们在研究中观察到的那样。
血浆中氧化损伤的标记物存在显著差异。干预组(吸入氢气组)MDA和3-NT水平明显低于对照组，说明氧化应激程度较低。因此，干预组的GSH和NP-SH水平显著升高，其氧化产物(非蛋白质二硫化物; NP-SS-NP)，这与本研究方法所提出的假设相符。肝组织与肝脏非缺血叶(右)和缺血叶(左)相比均有显著性差异。血浆和肝组织中谷胱甘肽混合二硫化物水平(G-SS-NP)的差异均不显著。
我们没有看到血浆和肝脏组织中氧化损伤标志物的显著差异，这可能是由于测量值的巨大离散，但观察到的变化趋势，无论是减少还是增加，都与我们对几乎所有选定标志物的预期一致。我们研究结果表明，在手术过程中给氢可以大大降低机体氧化应激水平，从而减轻严重的缺血-再灌注损伤。
我们通过组织学和生化检查以及氧化损伤标志物的检测，证实了2%分子氢吸入对家猪大肝切除的积极抗氧化作用。我们证明了这种方法是安全的，没有任何已知的副作用，易于使用，可以很容易地转化为人类医学。
在本实验研究中，我们证明了在肝脏大切除过程中吸入氢气可以显著降低肝脏缺血再灌注损伤相关的氧化应激水平，从而保护肝脏实质免受其负面影响。我们通过组织学切片和直接测定机体氧化应激水平证实了这一现象。此外，我们推测GMT水平可以作为术后早期缺血-再灌注损伤的预测因素，从而可以预测肝移植术后患者发生肝衰竭的风险。
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