氢气改善心脏骤停/心肺复苏后大鼠心、脑损伤的作用及机制研究

心脏骤停(cardiac arrest CA)是全球主要死亡原因之一,发病急且致残致死率高。

研究发现,CA患者在自主循环恢复后,临床上主要表现为心脏骤停后综合征(post-cardiac arrest syndrome PCAS),主要包括以下四方面:1、CA后脑功能损害;2、CA后心肌功能障碍;3、全身性缺血再灌注损伤;4、引起CA的原发病病情变化。调查显示,自主循环恢复(return of spontaneous circulation ROSC)后患者主要死于全身缺血再灌注引起的心脑功能障碍,早期45%～60%的ROSC的患者将出现严重的或致死性的心肺复苏后心肌功能障碍(post-arrest myocardial dysfunction PAMD),中晚期阶段68%的ROSC患者将死于复苏后脑损伤。因此,如何改善和提高心脏骤停的生存率及预后是亟待解决的问题。一直以来,心肌细胞以及大脑神经元被认为再生能力非常差。细胞程序性死亡的方式主要有三种类型:凋亡、自噬、坏死。自噬是一种早于凋亡发生的程序,具有抗凋亡和促凋亡的两面性,可以对细胞死亡进行调控,好似一把“双刃剑”,这取决于细胞周围环境的变化。种种迹象表明,再灌注后心肌细胞、神经元自噬异常增多可能导致心脏结构和脑功能损伤。早期、有效抑制自噬的发生,有可能减轻心脏骤停后心肌、脑缺血再灌注损伤,提高心脏骤停存活率及预后。氢分子作为选择性抗氧化剂,可以自由扩散到细胞成分中,研究发现氢分子减轻缺血再灌注损伤考虑与抗炎、抗氧化应激或者抗凋亡相关。
最近分子氢与自噬关系密切,研究显示富氢盐可以通过降低心肌细胞mTOR、AMPK、Beclin-1和LC3B蛋白表达水平,抑制心肌细胞自我吞噬作用,减轻心肌缺血再灌注损伤,减少心肌梗死面积。小鼠新生缺血性脑病模型中,富氢盐减轻脑水肿,缩小梗死面积,机制考虑与抑制神经元内质网应激促进自噬相关,发挥神经元保护作用。因而结合当前国内外的研究,我们主要探讨氢分子治疗在室息诱导的大鼠心脏骤停模型中心肌损伤及神经元损伤中的作用和机制。
研究目的本课题的主要目的在于:1.研究氢气对心脏骤停/心肺复苏大鼠心肌损伤的作用及其机制,.研究氢气对缺氧/复氧心肌细胞的保护作用和机制。2.研究氢气对心脏骤停/心肺复苏大鼠神经元损伤的作用及其机制。研究方法(一)动物实验1.大鼠窒息心脏骤停/心肺复苏模型的建立体重400-450g的雄性Wistar大鼠用于构建实验模型,首先腹腔注射戊巴比妥钠(45 mg/kg)进行实验动物麻醉,进行气管插管,并连接呼吸机,窒息法诱导心脏骤停,窒息10min后心肺复苏,启动呼吸机,进行人工胸外按压(200次/分钟),并同时静脉注射肾上腺素(2 μg/100g,每隔3分钟给药一次)。心脏骤停诱导成功定义为:平均动脉压(Mean arterial pressure MAP)<30mmHg;恢复自主循环(ROSC)的定义为:恢复窦性心率,MAP≥60 mmIHg,且持续5分钟以上。ROSC后持续10min以上者入组实验。2.分组及给药雄性Wistar大鼠随机分为6组(吸入常氧对照组:Sham-Normorxia,吸入氢气对照组:Sham-H2,吸入常氧复苏4小时组:CPR-4h-Normorxia,吸入氢气复苏4小时组:CPR-4h-H2,吸入常氧复苏72小时组:CPR-72h-Normorxia,吸入氢气复苏72小时组:CPR-72h-H2),每组10只大鼠。吸入常氧和吸入氢气对照组大鼠不进行窒息诱导心脏骤停和心肺复苏,给予机械通气,分别吸入空气和1.3%氢气/空气混合气1小时。吸入常氧和吸入氢气复苏组大鼠ROSC后分别吸入空气和1.3%氢气/空气混合气1小时。3.心率、血压监测大鼠体表心电图监测心率,股动脉置管监测平均动脉压,监测ROSC后30min、1h、2h心率和平均动脉压。4.血气分析的检测分别在ROSC后30min,1h,2h,4h,取股动脉血1.5ml,立即行血气分析。5.心功能监测利用心脏超声心动图测量ROSC后4h、72h左室短轴缩短分数(Left ventricular Fractional shortening,LVFS)以及左室射血分数(Left ventricular Ejection Fraction,LVEF)。6.血清中心肌损伤标志物检测分别于ROSC后4h、72h取血,将全血在4℃以1000 g条件下离心20分钟后,收集上层血清,用ELISA试剂盒检测心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)和肌酸磷酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme MB,CKMB)水平。7.心肌/海马区细胞凋亡检测于ROSC后4h、72h处死大鼠,取左心室心肌/海马区神经元组织,经过4%多聚甲醛固定后,进行石蜡包埋、切片操作。使用TUNEL染色检测心肌细胞凋亡水平。8.心肌细胞线粒体形态分析于ROSC后4h、72h处死大鼠,取左心室心肌组织,经过戊二醛固定,使用透射电子显微镜进行检查,ImageJ用于线粒体结构破坏的严重程度的半定量分析。9.心肌/海马组织Beclin-1、LC3B和p62蛋白检测于ROSC后4h、72h处死大鼠,取左心室/海马匀浆提取总蛋白,随后进行Western Blot实验检测Beclin-1、LC3B和p62蛋白。10.心肌组织/海马组织免疫组化ROSC后4h、72h处死大鼠,取左室心肌/海马用4%多聚甲醛固定后,石蜡包埋、切片。荧光显微镜下观察、拍照,通过Image J进行分析LC3B蛋白表达情况。11.神经功能损伤评分(NDS)大鼠ROSC后4h和72h,将大鼠从笼中取出进行单盲NDS检测。12.血清NSE和S100的水平的检测分别于ROSC后4h、72h取血,将全血在4℃,1000 g条件下离心20分钟,收集上层血清,用ELISA试剂盒检测NSE和S100的水平。
(二)细胞实验1.H9C2 低氧复氧(Hypoxia-reoxygenation,H/R)模型的建立细胞常氧培养条件为37℃,气体成分为95%空气+5%CO2。缺氧时的培养条件为37℃,气体成分为 94%N2+5%C02+1%O2。在进行细胞缺氧/复氧(Hypoxia/Reoxygenation H/R)处理时,首先将H9C2细胞在常氧细胞培养箱中培养24小时,然后转移至低氧培养箱培养24小时,再转移至常氧培养箱培养4小时或12小时。2.分组及给药细胞实验分为6组,分别是普通培养基对照组:Con-Vehicle,富氢培养基对照组:Con-H2,缺氧/复氧4小时+普通培养基组:H/R-4h-Vehicle,缺氧/复氧4小时+富氢培养基组:H/R-4h-H2,缺氧/复氧12小时+普通培养基组:H/R-12h-Vehicle,缺氧/复氧12小时+富氢培养基组:H/R-12h-H2。3.H9C2 细胞 Beclin-1、LC3B 和 p62 蛋白检测利用Western-Blot检测H9C2总蛋白中Beclin-1、LC3B和p62蛋白表达。4.H9C2细胞免疫荧光免疫荧光法检测细胞内LC3B蛋白的表达情况。5.mRFP-GFP-LC3B双色荧光腺病毒转染H9C2心肌细胞转染mRFP-GFP-LC3B双色荧光腺病毒,建立H/R模型,显微镜下观察,拍照;分辨,统计自噬小体(红色+绿色),自噬溶酶体(红色)的数量。
研究结果:
1.动物实验的基本资料和模型数据在动物实验方案中,CPR+H2组基线和模型数据与CPR-Normoxia组相比,差异没有统计学意义,其中包括MAP和HR,诱导CA时间,ROSC时间,NE用量。血气分析结果发现CPR-Normoxia组与CPR+H2之间也无显著差异。
2.心肺复苏后吸入氢气显著改善ROSC后大鼠的生存率和心脏功能CPR后吸入氢气可以显著提高ROSC后大鼠的生存率,改善ROSC后大鼠左心室心脏功能。
3.心肺复苏后吸入氢气显著改善ROSC大鼠的心肌细胞死亡和线粒体损伤吸入氢气可以减轻ROSC后大鼠血清中的CK-MB和cTnT水平,减少心肌细胞凋亡比例,减轻心肌细胞的损伤。吸入氢气显著改善心脏骤停/心脏骤停后大鼠心肌细胞的线粒体结构,减少心肌细胞中的自噬小体数量。
4.心肺复苏后吸入氢气显著减少心肌细胞中自噬相关蛋白的表达,抑制自噬激活Western blot实验结果显示,吸入氢气可以显著减少ROSC后大鼠左室心肌Beclin-1和LC3B的蛋白表达水平,显著升高p62的蛋白表达水平。同时,免疫组化结果显示吸入氢气可以显著降低大鼠左室心肌组织中LC3B的蛋白表达水平,抑制自噬的激活。
5.氢气抑制缺氧/复氧诱导的心肌细胞自噬Western blot实验结果显示,氢气能够显著减少H/R诱导的H9C2细胞中自噬相关蛋白Beclin-1和LC3B的表达,增加p62的蛋白表达。免疫荧光实验结果显示,氢气可以抑制H/R诱导的心肌细胞中自噬相关蛋白LC3B的表达,抑制自噬的激活。mRFP-GFP-LC3B双色荧光腺病毒实验结果显示,氢气可以抑制H/R诱导的H9C2细胞中自噬小体的形成,减少自噬小体的数量,抑制自噬的激活。
6.心肺复苏后吸入氢气有效改善ROSC后大鼠的神经功能大鼠神经功能损伤评分(NDS)数据显示,吸入氢气可以改善ROSC大鼠的神经功能。ELISA结果显示,吸入氢气可以减少ROSC后大鼠血清中中枢神经特异性蛋白(S100)和神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase NSE)的表达水平。
7.心肺复苏后吸入氢气显著减少海马神经细胞中自噬相关蛋白的表达,抑制自噬激活Western blot实验结果显示,吸入氢气显著减少ROSC后大鼠海马组织中自噬相关蛋白Beclin-1和LC3B的表达,增加p62的蛋白表达水平。免疫组化实验结果显示,吸入氢气显著减少ROSC后大鼠海马组织神经细胞中LC3B的蛋白表达水平,抑制自噬激活。

结论1.吸入氢气能够改善窒息诱导CA/ROSC大鼠的心脏和神经功能,减轻心肌和脑损伤,提高大鼠的生存率。2.氢气能够显著抑制心肌细胞和海马区域神经元中自噬的水平,减少心肌细胞和神经细胞的自噬性死亡。