氢气对难治性癫痫持续状态的治疗作用及机制研究

癫痫持续状态(status epilepticus,SE)是神经科的急危重症。目前的治疗原则主要为在对症支持治疗的前提下,尽快终止癫痫发作。但是,约有三分之一的患者在经过治疗后,其癫痫发作仍然难以被控制进而发展为难治性癫痫持续状态(refractory status epilepticus,RSE)。癫痫发作的时间越长,其对患者的危害越重。目前观点认为,持续的癫痫样放电会引起炎症反应、氧化应激、电解质紊乱、酸碱失衡等,导致神经元死亡,从而造成很多患者遗留不同程度的认知功能损伤。因此,如何帮助患者尽快终止癫痫发作、如何保护神经元和其他神经细胞、以及如何改善发作后遗留的认知功能损害已经成为神经科临床工作中迫切需要解决的难题。研究发现,在诸多神经系统疾病的动物模型中,氢气都可发挥保护性作用。例如脑缺血模型、帕金森病以及阿尔茨海默病模型等。氢气具有很强的自由扩散能力,可穿透血脑屏障快速扩散到组织中,甚至可穿透细胞膜进入细胞内。而且作为一种抗氧化剂,氢气能够选择性地减少最具细胞毒性的活性氧自由基:·OH。另外,研究表明氢气还可发挥抗炎、调控离子通道受体等作用。例如,在治疗痛觉过敏时,氢气可以抑制N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受体的亚单位NR2B的膜转运,进而调控NMDA受体功能,降低神经兴奋性。基于氢气的这些功能特性,我们推测氢气可能对RSE产生积极的治疗作用。
因此,我们对氢气在RSE中的作用及机制进行研究,期望为解决神经科临床中的难点问题提供新的思路和理论依据。目的:1、探讨氢气治疗对RSE大鼠癫痫发作的作用以及对NR2B亚基在海马细胞膜上的表达和磷酸化水平的影响。2、探讨氢气治疗对RSE导致的神经细胞死亡的影响。3、观察氢气治疗对RSE导致的认知功能损害的作用。方法:1、建立大鼠难治性癫痫持续状态模型后,通过行为学评分(Racine Scores)观察氢生理盐水(hydrogen-rich saline,HRS)治疗对模型大鼠癫痫发作严重程度的影响,通过脑电图(electroencephalogram,EEG)分析观察HRS对脑电图的波幅和功率的影响。然后利用Western blot对NR2B及p-NR2B在膜上的表达进行研究,观察它们在治疗后的变化。2、通过免疫荧光染色、透射电镜及Western blot等方法观察治疗后各组大鼠海马内细胞的死亡方式、其所在的区域以及炎症反应等的变化。3、通过水迷宫实验中的逃避潜伏期、在目标象限停留的时间和进入目标象限的频率等指标对各组大鼠在RSE后14天的认知功能状况进行分析。结果:1、行为学Racine评分和脑电图结果。行为学评分:与RSE+saline组的相比,RSE+HRS组的大鼠Racine评分没有明显的变化。脑电图结果:与RSE+Saline组的大鼠相比,RSE+HRS组中大鼠的脑电图波幅及功率均降低。2、NR2B表达和磷酸化水平的变化。与对照组(Con组)相比,癫痫发作后RSE组的大鼠海马细胞膜上NR2B的表达水平和磷酸化水平均随时间逐渐升高;NR2B的表达水平在RSE+Saline组和RSE+HRS组间没有明显差异,但RSE+HRS组的大鼠NR2B的磷酸化水平明显低于RSE+Saline组。3、细胞凋亡的变化。与Con组相比,RSE组在CA1区、CA3区和DG区的凋亡细胞明显增多。与RSE+Saline组相比,RSE+HRS组CA1区和DG区的凋亡细胞比例下降,CA3区没有明显变化。更进一步,对凋亡细胞类型的分析结果显示,在CA1区,与RSE+Saline组相比,RSE+HRS组神经元发生凋亡的比例降低,存活数量增加,而两组间发生凋亡的星形胶质细胞的数量和星形胶质细胞的总数量均没有差异;在DG区的神经元和星形胶质细胞中,与RSE+Saline组相比,RSE+HRS组的发生凋亡的细胞比例明显降低。4、细胞坏死性凋亡的变化。(1)形态学结果提示,与Con组相比,RSE组的大鼠海马内发生坏死性凋亡的细胞明显增多。Western blot结果和电镜结果进一步充分证实了坏死性凋亡的发生。坏死性凋亡主要分布在CA1区和DG区;在CA1区内发生坏死性凋亡的细胞主要为神经元,而在DG区内发生坏死性凋亡的细胞主要为星形胶质细胞。(2)Western blot结果提示,与RSE+Saline组相比,RSE+HRS组的坏死性凋亡相关的蛋白表达在CA1区域明显降低,包括MLKL、p-MLKL以及RIP3等。(3)CA1区的染色结果提示,相比于Con+Saline组和Con+HRS组,在RSE+Saline组的CA1区神经元群体中,MLKL阳性的细胞明显增多;而在RSE+HRS组,MLKL阳性的神经元相比RSE+Saline组有明显减少(4)DG区的染色结果提示,在DG区的星形胶质细胞中,MLKL阳性的细胞所占比例在RSE+Saline组和RSE+HRS组中,均显著高于Con+Saline组以及Con+HRS组,而RSE+HRS组中MLKL阳性的细胞所占的比例又明显低于RSE+Saline组。5、海马小胶质细胞的活化程度的变化。RSE+Saline组和RSE+HRS组的大鼠海马Iba1阳性的小胶质细胞数量均高于Con+HRS组和Con+Saline组的大鼠。与RSE+Saline组相比,RSE+HRS组的大鼠的Iba1阳性海马小胶质细胞的数目明显减少。6、大鼠认知功能的改变。RSE+Saline组和RSE+HRS组的大鼠的逃避潜伏期明显长于Con+HRS组和Con+Saline组的大鼠,而大鼠在目标象限停留的时间和进入目标象限的次数则明显少于Con+HRS组和Con+Saline组的大鼠。与RSE+Saline组相比,RSE+HRS组的大鼠的逃避潜伏期明显缩短,大鼠在目标象限停留的时间和进入目标象限的次数明显增加。
结论:1、HRS治疗对RSE大鼠的行为学发作评分没有明显影响,但可减轻RSE大鼠发作时的脑电幅度和功率;HRS治疗降低了NR2B亚基的磷酸化水平。2、HRS对RSE导致的神经细胞死亡有改善作用,可减少RSE诱导的海马神经细胞的凋亡和坏死性凋亡,尤其对阻止CA1区神经元的坏死性凋亡具有很好的作用效果;HRS对海马部位小胶质细胞活化也有明显的减轻作用。3、HRS治疗可以改善RSE引起的认知功能损害。4、HRS既能减轻发作期RSE大鼠脑电发作,又能增加RSE后大鼠海马神经细胞的存活数量并改善RSE大鼠的认知功能。这提示临床上减轻脑电异常放电,可能具有积极的治疗意义。