氢气对大肠腺癌细胞生长的 抑制作用及其影响因素

1975年，Dole 等证实高压氢气能抑制小鼠皮肤原发性鳞状细胞癌生长。随后研究人员通过富氢培养液对多种肿瘤细胞株干预的体内和体外实验均证实，氢气对肿瘤细胞的增殖、迁移以及接种形成的种植瘤有抑制作用。本研究原代培养不同病例来源的人大肠腺癌细胞，探讨氢气对癌细胞生长的抑制作用及影响因素。

 
方法：大肠腺癌细胞取自30例大肠腺癌患者。患者均于2015年11月 ～ 2017 年 7 月于山东省临沂市肿瘤医院行大肠癌手术，病理明确诊断。其中男 15 例，女9例; 年龄 49 ～ 78 ( 64.3 ± 9.4) 岁，≤60 岁11例、＞ 60 岁13例; 肿瘤位于结10例，位于直肠14 例; Dukes A ～ B 期 8 例，C ～ D 期 16 例; Ki67 阳性率≤70% 10 例，＞ 70% 14 例; 血浆 MDA≤3 μmol /L 14 例，＞ 3 μmol /L 10 例; 患者术前均未接受任何抗肿瘤治疗。术中无菌条件下取内部无坏死的肿瘤组织，充分清洗后用胰蛋白酶反复消化。收集消化液，加入 FBS 终止消化，1 000 r /min 离心 5 min，DMEM /F12 + 2% FBS 重悬细胞，以 3 × 105 个/mL 细胞密度进行原代培养。结合反复贴壁法和机械刮除法去除成纤维细胞。经细胞免疫组织化学 CK19 染色后， 24 例细胞质出现淡黄至棕黄色阳性颗粒，证明肿瘤均为上皮细胞来源，原代大肠腺癌细胞培养成功。当细胞融合约 80% 左右时传代，取 2 ～ 3 代对数生长期细胞随机分为两组，对照组给予含 10% 血清的DMEM /F12 培养液培养，氢气组给予含 10% 血清饱和氢气( ≥0.6 mmol /L) 的DMEM /F12 培养液培养。
 
两组细胞活性、克隆数量及凋亡情况比较
对每例患者来源的细胞分别统计氢气组和对照组的 OD 值，克隆数量及凋亡率，根据三项指标的变化， 分为氢气干预有效和无效细胞，分别统计两类细胞 上述三项指标。结果显示，氢气组 15 例患者的原代 结肠癌细胞 OD 值、克隆数量均低于对照组( P 均 ＜ 0.05) ，细胞凋亡率高于对照组( P ＜ 0.05) ，提示氢 气干预有效。氢气组 9 例患者的原代结肠癌细胞 OD 值、形成的克隆数量和细胞凋亡率与对照组比 较差异均无统计学意义( P均 ＞ 0.05) ，提示氢气干预无效。两组氢气干预有效及无效细胞相关指标比较见表 1、2。  
氢气对大肠癌细胞的干预效果与患者临床病理参数的关系
对 15 例氢气干预有效的大肠癌原代细胞来源患者的临床病理参数进行单因素分析， 结果显示，血浆 MDA ＞ 3 μmol /L 和癌细胞 Ki67 表 达阳性率 ＞ 70% 患者的原代癌细胞被氢气抑制的概 率高于血浆 MDA≤3 μmol /L 和癌细胞 Ki67 表达阳性率≤70% 患者( P 均 ＜ 0.05) ; 患者性别、年龄、肿瘤位置及 Dukes 分期对原代癌细胞是否被氢气抑制无显著影响( P 均 ＞ 0.05) 。见表 3。  
目前已知的能够被氢气抑制的细胞株包括人舌鳞状上皮细胞癌( HSC-4) 、人肺腺癌( A549) 、人纤维肉瘤( HT-1080) 、Ehrlich 腹水肿瘤( EAT) 、人结直肠癌( SW480) 、鼠大肠癌细胞( Colon26) 等，以大肠癌来源的细胞株较多，提示氢气有可能成为大肠癌患者新的抗肿瘤化学药物。
 
全身化学治疗是不适合手术切除的大肠癌患者的主要治疗方法。但化疗药物的毒副作用大，如奥沙利铂( OX) 导致的累积性末梢神经障碍，术后辅助化疗采用 FLOX方案的患者多出现腹泻等。氢气作为一种潜在的抗肿瘤药物，迄今为止未发现其 对人体有任何毒副作用，具有广阔的应用前景; 但是，目前关于氢气抗肿瘤的研究仅局限于对少数几 种细胞株的观察，试验结果的适用性较差，还因为缺少患者的信息，无法对临床病理特征与氢气抗肿瘤 效果的相关性进行分析，尚不能为氢气的实际应用 提供可靠的依据。
 
本研究采集 30 例大肠腺癌患者的手术切除标 本进行原代细胞培养，24 例培养成功，成 功率为80% 。污染是原代培养失败的主要原因，说明利用原代细胞培养进行氢气抗癌研究具有一定的局限性。本研究观察了氢气对 24 例原代癌细胞活性、增殖和凋亡的影响，发现氢气仅对 15 例患者来源的癌细胞具有抑制作用，有效率为 62.5% 。Asada 等报道氢气对人肝癌细胞株( HepG2) 没有抑制作用， 提示氢气的抗肿瘤作用受细胞株种类的限制。本研究提示，氢气的抗肿瘤作用会受到细胞株来源的影响，因为不同大肠癌患者的原代癌细胞类似于不同来源的细胞株。本研究中氢气有效原代癌细胞对照组的 OD 值、克隆数和凋亡率均数均高于氢气无效对照组，也提示癌细胞本身的生物学特性是影响氢气效果的重要因素。
 
目前认为，清除活性氧(ROS) 、抗氧化是氢气发挥生物学作用的主要机制，包括抗肿瘤作用。 不同肿瘤细胞的基因突变对ROS的产生和清除途径有不同的影响，细胞内ROS水平不一致可能是氢气抗肿瘤作用出现差异的原因。MDA是自由基引起的脂质过氧化过程中生成的一种醛类物 质，是ROS氧化细胞膜上的多不饱和脂肪酸形成的脂质过氧化物，其血浆含量可间接反映组织及细胞受ROS损伤的程度。血浆 MDA 含量高的患者可能处于氧化还原失衡的状态，有助于氢气发挥抗肿瘤作用。目前已证实氢气能够降低氧化应激时细胞内 MDA 含量。氧化/还原剂作为化疗药物治疗肿瘤目前尚有争议。因为肿瘤细胞的氧化还原状态受很多因素的影响，对肿瘤所起的作用也不确定。一些研究通过检测患者的临床指标，如胰腺癌和肝癌患者的血浆硫氧还蛋白、肿瘤组织的抗氧化能力等预测氧化/还原剂的抗肿瘤疗效。本研究发现，血浆 MDA 能够影响氢气对原代癌细胞的抑制作用，提示将来可能通过检测 MDA 预测氢气的抗肿瘤效果，筛选适合氢气治疗的大肠癌患者。
 
持续的增殖活性是恶性肿瘤细胞的主要特征，很多抗肿瘤药物通过抑制肿瘤细胞增殖发挥作用。Ki67 是反映肿瘤细胞增殖活性、判断肿瘤侵袭能力的重要参考指标，在临床中广泛应用。 有报道称氢气能够降低肿瘤组织 Ki67 表达。本研究发现，大肠腺癌组织 Ki67 表达普遍较高，以阳性率为 70% 作为界限进行分析，界限两侧癌细胞被氢气抑制的概率也有显著差别。这一结果也与细胞实验中氢气有效15例原代癌细胞对照组的克隆数和OD 值均数均高于氢气无效 9 例对照组相吻合。究其原因，可能与增殖旺盛的恶性肿瘤细胞增殖信 号较强，ＲOS 在信号传导途径中具有中介作用，有利于氢气发挥作用有关。
 
综上所述，氢气对原代人大肠腺癌细胞生长具有一定的抑制作用，血浆MDA 含量和肿瘤 组织 Ki67 表达可能影响氢气的临床抗肿瘤效果。