最初,氢气(Hydrogen gas,H2)被认为是生理性惰性气体。1975年《Science》报道,高压H2干预对小鼠皮肤癌有明显改善作用,然而氢气生物学效应并未引起足够重视。2007年《Nature Medicine》撰文报道H2可以作为抗氧化剂改善大鼠脑缺血损伤,从而引起学术界的轰动。2013年《Plant Cell and Environment》报道,外源施用H2可以缓解百草枯诱导的紫花苜蓿幼苗氧化损伤。2014年《Plant Physiology》发文报道,外源施用H2可以增强拟南芥耐旱性。自此,氢气生物学效应及其分子机制的研究逐渐受到青睐。氢气生物学主要包括氢医学和氢农学。与氢农学相对应的实践是氢农业,氢农学是研究氢农业相关规律的学科。氢农业是综合应用于种植业、畜牧业及水产业的一种新型绿色生态农业,其主要分为大田氢农业、设施园艺氢农业、家庭氢农业等。氢农业涉及多个研究领域,本研究从植物耐旱和耐盐性以及花卉保鲜的机理研究入手分别以紫花苜蓿、拟南芥以及洋桔梗切花为试验材料;通过使用药理学、分子生物学和遗传学等手段探究H2提高植物耐旱和耐盐性以及延长鲜切花保鲜的分子机制,旨在为H2在农业上的广泛运用提供理论和实践基础。本研究的具体结果如下:已经知道,外源施用H2和一氧化氮(Nitric oxide,NO)均可以提高植物渗透胁迫(模拟干旱)耐性,但尚不清楚H2和NO在增强紫花苜蓿渗透胁迫耐性过程中是否存在相互作用。在这项研究中,外源施用氢气(以富氢培养液形式)可以显著提高紫花苜蓿幼苗NO产生,进而提高幼苗渗透胁迫耐性。结合富氮培养液确定了富氢培养液的作用主要来源于H2,部分来源于富氢导致的低氧效应。外源施用NO清除剂可以抑制H2缓解渗透胁迫诱导的幼苗生长抑制,提示NO可能参与了外源H2提高紫花苜蓿幼苗渗透胁迫耐性。外源施用硝酸还原酶(一种NO合成酶)抑制剂(钨酸盐)提示,H2诱导NO的产生主要来源于硝酸还原酶催化途径。进一步的研究证实,H2分别通过诱导和降低脯氨酸合成酶和脯氨酸降解酶的活性/基因表达提高渗透胁迫下苜蓿幼苗脯氨酸含量,进而增强幼苗渗透胁迫耐性。组织化学染色分析幼苗脂质过氧化和质膜完整性证实,外源施用H2可以显著缓解渗透胁迫诱导的脂质过氧化和质膜完整性损伤。此外,H2通过提高渗透胁迫下抗氧化酶活性和相应的转录本水平增强紫花苜蓿幼苗的抗氧化能力。上述结果提示,H2提高苜蓿渗透胁迫耐性与重建细胞内氧化还原稳态有关。最后,本研究初步证实H2的作用还可能部分与依赖于NO的蛋白质S-亚硝基化修饰有关。综上所述,外源施用H2介导的紫花苜蓿幼苗渗透胁迫耐性与NO诱导的脯氨酸积累与氧化还原稳态重建相关。研究显示,外源H2和内源褪黑素(Melatonin,MT)均可以提高植物耐盐性,但内源H2是否参与提高植物耐盐性以及H2与MT在植物响应盐胁迫之间的相互作用尚未报道。在这项研究,外源施用H2通过上调5-羟色胺N-乙酰基转移酶(SNAT,MT合成途径中的关键酶)基因表达提高MT产生,进而增强野生型拟南芥耐盐性。然而,外源施用H2不能降低atsnat(拟南芥SNAT缺失突变体)的盐敏感性提示,MT可能参与了外源H2提高拟南芥耐盐性。本研究进一步通过使用CrHYD1转基因拟南芥(过表达莱茵衣藻产氢酶基因(CrHYD1),模拟内源H2产生)、atsnat/CrHYD1-4杂交株系以及atsnat突变体验证上述结论。与野生型相比,CrHYD1 转基因株系(CrHYD1-3 和 CrHYD1-4)和 atsnat/CrHYD1-4杂交株系的内源氢气含量较高,且CrHYD1株系的耐盐性较高。然而,与CrHYD1-4株系相比,atsnat/CrHYD1-4杂交株系的盐敏感性更高。进一步的研究结果证实,CrHYD1株系中SNAT的mRNA水平和MT含量更高。上述结果提示,MT作为内源H2的下游信号参与提高拟南芥耐盐性。盐胁迫下拟南芥幼苗钠(Na+)和钾(K+)含量分析显示,与野生型相比,CrHYD1株系的Na+/K+更低,而atsnat/CrHYD1-4和atsnat的Na+/K+较高。基因表达分析显示,CrHYD1转基因幼苗中离子转运蛋白基因(SOS1、SOS2、SOS3、AKT1和NHX1)表达量较高,而在atsnat/CrHYD1-4和atsnat中的表达量较低。非损伤微测技术检测幼苗根部离子流速证实,与野生型相比,活体状态下CrHYD1株系的Na+外排流速较高、H+内流流速较高,而K+外排流速较高;而atsnat/CrHYD1-4和atsnat幼苗呈现相反的趋势。此外,与野生型相比,CrHYD1株系的过氧化氢含量和脂质过氧化水平较低、抗氧化酶活性以及相应的转录本水平较高;相反地,内源H2的作用在atsnat/CrHYD1-4中被抑制。综上所述,内源H2通过上调SNAT表达诱导MT积累激活离子转运蛋白和抗氧化酶基因表达,从而调节根部离子转运并增强抗氧化能力,维持盐胁迫下幼苗的氧化还原和离子稳态,进而增强拟南芥耐盐性。综上所述,依赖于SNAT产生的MT,至少在提高拟南芥耐盐性方面是内源H2的下游信号分子。
研究证实,外源施用H2可以延长采后百合和玫瑰鲜切花保鲜;但是,内源H2是否以及如何延长切花保鲜的相关机理仍然不清楚。本研究以洋桔梗鲜切花为试验材料,证实切花衰老期间内源氢气稳态和氧化还原平衡被破坏。气相色谱法测定内源H2浓度证实,外源施用氢气(以富氢水形式)可以提高切花内源H2水平,但2,6-二氯酚靛酚(DCPIP,内源H2合成抑制剂)抑制了内源H2产生。切花的瓶插时间、花径和鲜重数据显示,与对照组相比,外源施用H2延长了洋桔梗鲜切花保鲜,而外源施用DCPIP加速了切花衰老。然而,当H2和DCPIP同时施用时,H2部分抑制了 DCPIP诱导的切花衰老。进一步的研究表明,外源施用H2通过减缓脂质过氧化和增强抗氧化酶活性延长洋桔梗鲜切花保鲜。此外,与对照组相比,外源施用H2显著抑制了可溶性蛋白和叶绿素的降解,同时提高脯氨酸积累。然而,外源施用DCPIP抑制了 H2的上述作用。综上所述,H2通过增强细胞抗氧化能力和脯氨酸合成、抑制可溶性蛋白和叶绿素的降解延长洋桔梗鲜切花保鲜,进而延长洋桔梗切花保鲜期。本研究分别从氢农业的三个重要领域展开研究,揭示了外源施用H2通过调动NO信号参与提高紫花苜蓿幼苗渗透胁迫耐性、褪黑素作为内源H2的下游信号分子增强拟南芥耐盐性以及内源H2延长洋桔梗鲜切花保鲜期的分子机制。上述研究结果不仅促进了氢农学相关分子机制的研究,而且为H2在农业生产、园艺栽培和家庭中的运用提供理论指导,同时为大田氢农业、设施园艺氢农业和家庭氢农业的发展打下基础。
