目的下肢缺血再灌注(Limb ischemia-reperfusion,LI/R)是临床上常见的病理过程,不仅会损害骨骼肌的局部结构与功能,同时也会引起全身炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome,SIRS),损伤其他远端器官如心脏、肺、肾、脑,甚至多器官功能障碍衰竭综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS),最终会导致死亡,目前尚无有效的治疗方法。值得注意的是,肺是回流静脉血最先进入的器官,静脉血液中的有害物质首先作用于肺,因此肺是最脆弱的器官之一,易引起急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)。近年来,对LI/R-ALI机制的研究多集中在氧化应激方面,大量活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的生成被认为是LI/R-ALI的重要因素之一。最近,越来越多的研究发现氢分子具有抗氧化,抗炎、抗凋亡的作用,并对多种器官的缺血再灌注损伤具有保护作用,然而是否能减轻下肢缺血再灌注引起的急性肺损伤,目前尚不清楚。Nrf2/ARE通路是迄今发现最为重要的抗氧化应激通路,但下肢缺血再灌注对肺内Nrf2/ARE通路的影响以及氢分子对肺内Nrf2/ARE通路的影响尚不清楚。此外,自噬作为一种新的细胞程序性死亡方式,在缺血再灌注中的作用越来越受到人们的关注,但其在缺血再灌注损伤中的作用及氢分子对自噬的作用尚存争议。基于上述问题,我们建立了下肢缺血再灌注致急性肺损伤的小鼠模型,来探讨氢分子对下肢缺血再灌注急性肺损伤的保护作用及其机制,以及Nrf2/ARE通路及自噬在这一病理过程中的作用机制。研究方法动物:本实验选用8-12周龄的健康C57BL/6野生型小鼠,雄性,体重大约在20-25g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,并在山东第一医科大学动脉粥样硬化研究所饲养,实验动物房间12小时的光/暗交替循环,小鼠自由进食和饮水。房间温度保持在22℃±3℃,相对湿度保持在60%±5%,并且所有实验均经山东第一医科大学实验动物伦理委员会批准,并按照IASP(国际疼痛研究协会)的指导原则使用动物。实验分为三组:假手术组(Sham组)、模型组(Model组)与氢生理盐水组(Hydrogen组)。模型及给药:30只小鼠随机分为三组:(1)假手术组(Sham,n=10);(2)模型组(Model,n=10);(3)氢生理盐水组(Hydrogen,n=10)。提前制备氢生理盐水。麻醉小鼠,切开右后肢皮肤,游离出股动脉,在腹股沟韧带附近使用动脉夹将股动脉夹闭,缺血4h后,去除动脉夹并恢复右下肢的血流,假手术组(Sham)只游离不夹闭。假手术组(Sham)与模型组(Model)再灌注的同时腹腔立即注射5ml/kg的生理盐水;氢生理盐水组(Hydrogen),再灌注的同时腹腔立即注射5ml/kg的氢生理盐水。再灌注15h后取血,脱臼处死三组中的所有小鼠。切开胸腔,暴露心脏,将灌流针插入左心室,小剪刀剪开右心耳,用冷生理盐水进行心脏灌流,随后取出肺组织,部分保存于-80℃下备用,部分保存于4%多聚甲醛中固定。HE染色:取出在4%多聚甲醛中固定的肺组织,石蜡包埋并切成5μm的薄片,脱蜡水化后经伊红-苏木素染色,置于正置显微镜下观察。MDA含量与SOD活性的测定:制备肺组织匀浆,分别用TBA法和WST-1法检测肺组织中的MDA含量与SOD活性,用酶标仪读取各样本的吸光度值。免疫组织化学检测肺组织中的Nrf2,HO-1,NQO1:取出在4%多聚甲醛中固定的肺组织,石蜡包埋并切成5μm的薄片进行免疫组织化学染色,置于显微镜下观察并用Image-proplus 6.0分析。蛋白提取及Western blot:分别使用细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒,RIPA-蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂混合物抽提肺组织核蛋白,总蛋白和磷酸化总蛋白后,利用Western blot检测核蛋白Nrf2,胞浆蛋白HO-1,NQO1及自噬相关蛋白Beclin-1,Atg-5,LC3B,P62,P-m TOR的表达。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测神经酰胺:LC-MS/MS法分析肺组织内神经酰胺的含量。统计学分析:统计学分析采用Graph Pad Prism 5.0软件进行单因素方差分析,使用Tukey法对各组进行多重比较。
定量实验数据都表示为mean±SEM。当P值小于0.05时,认为两组数据有统计学差异。结果1.氢生理盐水可以改善下肢缺血再灌注引起的肺损伤假手术组可观察到正常的肺组织结构,肺泡结构清晰完整,肺泡壁薄且细胞排列整齐,连接紧密,无出血与炎症细胞浸润等现象。模型组肺组织结构明显紊乱,肺泡壁较厚,细胞排列不整齐,连接不紧密,肺组织内有明显的出血和炎性细胞浸润。氢生理盐水处理后肺组织损伤的现象都得到明显改善。2.氢生理盐水能有效抑制下肢缺血再灌注引起的氧化应激与假手术组相比,模型组MDA含量显著增加,SOD活性显著降低,而氢生理盐水处理后能明显改善脂质的过氧化,MDA含量明显减少,SOD活性显著增强。3.氢生理盐水可以通过上调Nrf2信号通路增强抗氧化能力(1)免疫组织化学检测显微镜下显示,假手术组内核蛋白Nrf2及下游胞浆蛋白HO-1及NQO1呈现出低表达的状态,与假手术组相比,模型组与氢生理盐水组肺组织内核蛋白Nrf2及下游胞浆蛋白HO-1及NQO1呈现出高表达的状态,尤其是在肺泡上皮细胞,及支气管表达最为明显。采集图像后,用Image-proplus 6.0图像软件分析IOD,模型组肺组织内Nrf2,HO-1,NQO1的IOD明显高于假手术组,氢生理盐水组肺组织内Nrf2,HO-1,NQO1的IOD明显高于模型组。(2)Western blot结果显示,模型组,氢生理盐水组与假手术组相比肺组织内核蛋白Nrf2及下游胞浆蛋白HO-1及NQO1表达均显著增加,氢生理盐水组与模型组相比肺组织内核蛋白Nrf2及下游胞浆蛋白HO-1及NQO1表达进一步增加。4.氢生理盐水可以抑制由下肢缺血再灌注引起的肺组织自噬上调模型组与假手术组相比,Becin-1,Atg-5和LC3B蛋白表达明显增加,然而,经过氢生理盐水处理后,Becin-1,Atg-5和LC3B蛋白表达明显减少。P62的表达水平与Beclin-1,Atg-5和LC3B的表达水平结果相符合,模型组与假手术组相比,P62表现出低表达,而氢生理盐水处理后,P62蛋白表达增加。此外还检测了自噬的上游关键调节因子m TOR,模型组中的m TOR磷酸化水平降低,但氢生理盐水组中的磷酸化水平显著增加。5.氢生理盐水可以减少由下肢缺血再灌注引起的肺组织内神经酰胺的蓄积Cer d18:1/16:0与Cer d18:1/24:1是神经酰胺的重要组成部分,结果显示,与假手术组相比,模型组肺组织内神经酰胺含量明显增多。而与模型组相比,氢生理盐水组肺组织内神经酰胺含量明显减少。结论1.氢分子可以改善由下肢缺血再灌注引起的肺损伤;2.氢分子可以通过激活Nrf2/ARE抗氧化应激通路来减轻肺组织的氧化应激损伤;3.氢分子可以抑制由下肢缺血再灌注引起的肺组织自噬上调;4.氢分子可以减少由下肢缺血再灌注引起的肺组织内神经酰胺的蓄积。
