目的:衰老是一个复杂的过程,主要表现在生理功能的减退同时会伴随着许多慢性疾病的发生。目前存在多个衰老理论来解释这个复杂的过程,其中包括自由基/氧化应激学说,该学说认为衰老与活性氧(Reactive oxygen species,ROS)在细胞或者组织中过度积累导致的氧化损伤密切相关。基于这种衰老机制,抗氧化剂可能在治疗衰老相关疾病方面具有潜在的治疗价值。氢分子(Molecular hydrogen,H2)是无色、无味的小分子气体,许多研究认为氢分子在体内可以起到清除有害自由基,减少氧化损伤的作用。目前氢分子供体多种多样,何种氢干预方式对何种疾病效果更好,也是学界关注的一个重要问题。本课题组前期研究发现,H2可以降低氧化低密度脂蛋白和过氧化脂质水平,并改善高胆固醇血症患者的高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)功能。但H2对衰老相关的氧化应激指标和HDL功能的影响及其机制尚不明确。本研究采用D-半乳糖(D-galactose,D-gal)诱导的自由基损伤导致衰老小鼠模型,通过多种途径:4%氢气吸入(4%Hydrogen,4%H2)、饮用富氢水(H2-rich water drinking,HRW)、和腹腔注射饱和氢生理盐水(H2-rich saline injection,HRS)给予小鼠H2,测定血浆中衰老相关生物标志物和多个组织中的氧化应激水平,验证了不同氢干预方式对该衰老模型的作用效果。同时选择对氧化应激效果明显的氢干预途径--4%H2,来探究H2对HDL功能损伤的保护作用及其相关机制。方法:研究一:氢分子对D-gal诱导衰老小鼠模型衰老指标的影响6周龄雄性C57小鼠,随机分为6组(n=10/组):(i)普食对照(Con)组,(ii)D-gal模型(D-gal)组,(iii)D-gal加4%H2(D-gal+4%H2)吸入干预组,D-gal干预小鼠每天吸入4%H2,2小时。(Ⅳ)D-gal加饮用富氢水(D-gal+HRW)干预组,D-gal干预小鼠每天自由饮用富氢水。(Ⅴ)D-gal加腹腔注射富氢生理盐水(D-gal+HRS)组,D-gal干预小鼠每天给予腹腔注射富氢生理盐水(700μmol/L)剂量为0.1 m L/10g。(Ⅵ)阳性对照组D-gal加阿托伐他汀钙灌胃0.1 m L/15 mg/kg(Atorvastatin,Ator)。除对照组外,其余各组均给予D-gal皮下注射200 mg/kg体重。实验干预8周。首先,观察并记录小鼠生长状态,内眦静脉取血并用含有EDTA抗凝剂的EP管收集血液,取材,记录小鼠体重、胸腺、肝脏和脾脏重量。计算体重变化,肝脏指数、胸腺指数、脾脏指数和肝脏指数。脏器指数计算公式=脏器重量/小鼠体重。其次,应用试剂盒检测了血浆中以游离脂肪酸(Free fatty acids,FFA)为代表的血脂指标、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-6(Interleukin-6,IL-6)为代表的炎症指标、晚期糖基化终产物(Advanced glycation end products,AGEs)为代表的糖化指标、总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,TAOC)为代表的氧化指标、:丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)为代表的肝功能指标和肌酐(Creatinine,CRE)为代表的肾脏指标。同时,我们还使用HE染色,观察了小鼠肝脏组织的形态变化。最后,使用试剂盒检测肝脏、脑、心脏组织中的丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、脂质过氧化物(Lipid peroxides,LPO)的含量和过氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的活性,来验证氢气干预对氧化应激的影响。研究二:氢分子对D-gal小鼠HDL结构功能损伤的影响(Con组,D-gal组,D-gal+4%H2应用于该实验)1.HDL分离:将3只小鼠血浆混和成一个待检测的血浆样本,每组4个样本。应用快速蛋白质液相色谱(Fast protein liquid chromatography,FPLC)根据层析法分离出血浆中的HDL。2.HDL血脂检测:应用Bradford蛋白浓度测定试剂盒定量测定血浆中HDL的蛋白浓度。3.HDL抗氧化能力及相关酶检测:超速离心法分离小鼠血浆中的HDL,用检测生成MDA的含量来评估低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)的氧化的程度。同时试剂盒检测血浆中脂蛋白磷脂酶A2(Lipoprotein-associated phospholipase A2,Lp-PLA2)的活性。4.HDL的脂质组学:将分离好的HDL使用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法进行靶向脂质组学检测。5.HDL的蛋白组学:将分离好的HDL,使用Label-free法进行蛋白组学分析。统计分析实验结果采用Graph Pad Prism6软件进行统计分析。数据用均值±标准差(Mean±SD)表示。两组组间数据比较采用t检验进行分析。多组比较采用单因素方差分析。当P<0.05时,认为具有显著差异。所有统计分析均使用SPSS 20.0进行。结果一、氢分子对D-gal诱导衰老小鼠模型衰老指标的检测结果1.基本指标结果:D-gal组小鼠的体重、肝脏指数、胸腺指数均显著下降(P<0.05),脾脏指数无明显变化。氢气干预后,三种给氢途径对体重降低没有显著改变;HRS可以显著提升肝脏指数(P<0.05);4%H2可以显著提升胸腺指数(P<0.05);HRW可以显著提升脾脏指数(P<0.05)。2.血浆脂质检测结果:D-gal组小鼠血浆FFA水平显著升高(P<0.001)。不同的给氢途径干预后均可以显著降低FFA水平(HRW组P<0.001,HRS组P<0.001,4%H2组P<0.01)。3.炎症因子检测结果:D-gal组小鼠血浆TNF-α水平显著上升(P<0.05)。不同的给氢途径干预后TNF-α水平均显著下降(HRW、HRS组P<0.001,4%H2组P<0.05)。4.糖化指标检测结果:D-gal组小鼠血浆AGEs水平显著上升(P<0.01)。不同的给氢途径干预后均可以降低AGEs水平(HRW组P<0.001,4%H2组P<0.05,HRS组P>0.05)。5.氧化指标检测结果:D-gal组小鼠血浆TAOC水平降低(P<0.01)。不同的给氢途径干预后均可以升高TAOC的水平(HRW、HRS组P<0.001,4%H2组P<0.05)。6.肝损伤标志物检测结果:D-gal组小鼠血浆中ALT活性显著上升(P<0.01),不同给氢途径均可显著降低其活性(P<0.05)。7.肾损伤标志物检测结果:D-gal组小鼠血浆中CRE水平显著上升(P<0.05),吸入4%H2可显著降低其活性(P<0.05)。8.HE染色结果:HE染色后,Con组肝细胞正常、排列规则、肝索完整。相反,D-gal组有大量炎症细胞浸润并且伴有肝细胞凋亡。不同的给氢途径治疗后均得到缓解,表现为炎症细胞浸润减少,坏死的肝细胞减少。9.肝脏组织氧化应激水平检测结果:D-gal组小鼠肝脏组织中LPO、MDA水平显著上升(P<0.001),SOD活性显著下降(P<0.001)。三种给氢途径均可以降低LPO、MDA的水平(P<0.05),提高SOD的活性(P<0.05)。10.脑组织氧化应激水平检测结果:D-gal组小鼠脑组织中LPO、MDA水平显著上升(P<0.05),SOD活性显著降低(P<0.05)。4%H2吸入可以显著降低LPO、MDA水平(P<0.05),三种给氢途径均可提高SOD活性(P<0.01)。11.心脏组织氧化应激水平检测结果:D-gal组小鼠心脏组织中LPO、MDA水平显著上升(P<0.001),SOD活性有降低趋势。4%H2吸入可以降低LPO、MDA水平(P<0.05),三种给氢途径对SOD活性没有显著影响。
二、氢分子对D-gal小鼠HDL结构功能损伤的保护作用的结果通过以上实验数据,对比三种给氢途径(4%H2,HRW,HRS)的作用效果,发现4%H2在缓解氧化应激诱导的衰老过程作用效果更为明显。因此接下来实验选择4%H2组的样本进行下一步的研究。1.4%H2干预的对衰老指标的干预结果:D-gal组小鼠血浆、肝脏和肾脏中的AGEs、血浆中的IL-6和MDA含量均显著上升(P<0.05),4%H2干预后均显著降低(P<0.05)。2.HDL抗氧化能力检测结果:D-gal组HDL的抗LDL氧化能力降低,MDA的形成增加(P<0.01)。4%H2干预后HDL抗氧化能力显著提高(P<0.05)。3.HDL相关酶检测结果:D-gal组血浆中Lp-PLA2活性增加(P<0.05),H2干预可显著降低Lp-PLA2活性(P<0.05)。4.HDL的脂质组学检测结果:HDL样本中共定量450种脂质,其中有146种脂质表现出显著的差异。与Con组相比,D-gal组有144种脂质表达显著上调(P<0.05且|FC|>1.2),主要为甘油三酯类。与D-gal组相比,D-gal+4%H2组14种脂质改变,且均显著下调(P<0.05且|FC|>1.2),主要为甘油三酯和胆固醇酯类。5.HDL的蛋白组学检测结果:HDL样本中共定量479种蛋白。与Con组相比,D-gal组有18种蛋白表达显著上调,8种蛋白表达显著下调(P<0.05且|FC|>1.2)。与D-gal组相比,D-gal+4%H2组有4种蛋白显著上调,7种蛋白显著下调(P<0.05且|FC|>1.2)。结论:1.不同给H2途径可改善D-gal诱导衰老小鼠的氧化应激。2.在不同的给H2途径中,4%H2吸入对降低部分组织的氧化应激标志物效果最明显,而其他途径在大多数指标上的效果相同。3.4%H2吸入可改变D-gal小鼠血浆HDL的脂质组成,主要为甘油三酯。4.4%H2吸入可改变D-gal小鼠血浆HDL的蛋白质组成,改善HDL的抗氧化功能。5.4%H2对氧化应激引起的衰老的缓解作用可能与改善HDL结构功能相关。6.H2治疗可能是一种很有前途的抗衰老干预措施。
