目的： 脓毒症(sepsis)是感染因素诱发的全身炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome, SIRS),是烧伤、创伤和大手术等的常见并发症,是危重症患者死亡首要因素。革兰阴性菌是诱发脓毒症的主要病原体,而脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是革兰阴性菌致病的主要成分,可激活体内免疫细胞(如巨噬细胞),发挥一系列病理生理反应。单核／巨噬细胞是机体对抗外界有害刺激的识别细胞,是抵御外界反应的第一道防线,通过调节细胞内外活性和释放炎症介质,在机体对损伤或感染的炎症反应过程中发挥着举足轻重的作用。氢气是自然界中最小的分子,是最简单、最富有的元素,又是无色、无嗅、无味、具有一定还原性的双原子气体。近年来发现其具有抗氧化、抗炎症、抗凋亡等作用,对多种疾病具有治疗意义。利用脓毒症动物模型,我们发现氢气具有明显的抗炎作用,但具体机制不清。本实验拟探讨含氢培养液对LPS刺激Raw264.7巨噬细胞增殖活力和凋亡、炎症因子释放的影响以及相关机制。方法： 小鼠巨噬细胞系Raw264.7,培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基,接种于6孔或96孔细胞培养板,3mL/孔或200μL/孔,细胞密度2×106/mL。 第一部分：含氢培养液对LPS所致Raw264.7细胞增殖活力和凋亡的影响。实验分组如下：Con组、Con+H2组、LPS组和LPS+H2组。Raw264.7细胞培养24h后,换成正常培养液或不同浓度的含氢培养液培养,同时给予LPS(1μg/mL)或等量PBS (LPS溶剂)处理24h,应用MTT法和Annexin V/PI法检测细胞增殖活力和凋亡情况。 第二部分：含氢培养液对LPS所致Raw264.7细胞炎症反应的影响。实验分组和处理同第一部分,用LPS和含氢培养液处理24h后,收集细胞培养液,检测炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-10;此外,应用饱和含氢培养液(0.60mmol/L)培养细胞,于LPS处理后0h、3h、6h、12h、24h收集细胞培养液,检测炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-10。 第三部分：HO-1在含氢培养液调控LPS致Raw264.7炎症反应中的作用。实验分为四组：Con组、Con+H2组、LPS组和LPS+H2组。氢气处理组用饱和含氢培养液(0.60mmol/L)培养,分别于LPS处理后Oh、3h、6h、12h和24h收集细胞,测定HO-1活性和HO-1表达水平。进一步利用HO-1特异性拮抗剂ZnPP-Ⅸ (20μmol/L),通过检测炎症因子TNF-α、IL-1β、HMGB1和IL-10的水平,观察HO-1在含氢培养液调控炎症反应中的作用。
结果： 第一部分：氢气对巨噬细胞无明显毒性影响(P>0.05)。含氢培养液对细胞活力无明显影响(P>0.05),但可以改善LPS导致的巨噬细胞活力情况,呈剂量依赖性(P<0.05)。LPS导致大量细胞凋亡,给予含氢培养液培养,细胞凋亡明显减少(P<0.05)。 第二部分：LPS培养细胞导致炎症因子释放增加(P<0.05),促炎因子TNF-α和IL-1p在6h时到达释放高峰,而抗炎因子IL-10和晚期促炎因子HMGB1在24h达到释放高峰,给予不同浓度的含氢培养液处理均可以降低促炎炎症因子的释放、增加抗炎炎症因子的释放,0.30和0.60mmol/L的含氢培养液治疗作用明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。 第三部分：与细胞正常情况下HO-1的活性和表达相比,LPS可以诱发巨噬细胞HO-1的活性和表达(P<0.05)。饱和含氢培养液可以提高LPS处理的巨噬细胞HO-1的活性和表达(P<0.05),且具有时间依赖性。利用Znpp抑制HO-1的活性发现,Znpp逆转了含氢培养液对巨噬细胞炎症因子的治疗作用(P<0.05),说明Znpp抑制HO-1的活性,进一步抑制含氢培养液对过度炎症反应的调节作用。 结论： 含氢培养液可以减轻LPS导致的巨噬细胞活力下降,可以减少LPS诱导的巨噬细胞凋亡；含氢培养液可以减轻LPS诱发的巨噬细胞过度炎症反应,减少促炎细胞因子的释放,增加抗炎因子的表达,且具有浓度依赖性；HO-1在含氢培养液调控炎症反应中起重要作用。
