第一部分纳米微泡的制备和表征 研究背景 动脉血栓是常见的心血管疾病之一,具有发病率高、死亡率高、致残率高等特点,是缺血性脑卒中、心肌梗塞、下肢动脉栓塞、内脏动脉栓塞等多种心血管疾病的主要发病机制,严重危及人类生命和健康。动脉血栓形成会导致病变血管的血流量急剧减少,引发细胞和组织的严重损伤,从而导致多器官功能障碍,甚至死亡。快速清除血栓、疏通血管、防止血管再次闭塞是动脉血栓改善
的关键要求。目前临床上有效的改善方法包括手术干预和药物改善。然而,外科手术存在一系列与设备作用机制相关的并发症,具有风险高、成本高和侵入性等弊端。抗血栓药物由于半衰期短、靶向性差、利用率低,需要多次大剂量全身给药,这不仅增加了额外的医疗费用,也带来了出血、过敏、血压不稳定等副作用。此外,由于抗栓药物仅作用在血栓表面,难以渗透进血栓内部,临床上无法获得理想的改善效果。纳米技术可以将药物制成纳米颗粒输送至靶病变部位进行干预,这为抗血栓改善提供了新的思路。因此,深入探索如何将抗血栓药物靶向递送至血栓部位或可开启动脉血栓改善的新篇章。 研究目的 制备一种可静脉注射的基于血小板膜(Platelet membrane,PM)的纳米微泡(PM@PLGA@P/H2-UK)来输送尿激酶(Urokinase,UK)与氢气(Hydrogen,H2),并对其表征。
研究方法 首先通过双重乳化法合成PLGA@PFH纳米微泡,然后在密闭条件下充入H2,制成PLGA@P/H2纳米微泡。小鼠取血,离心及反复冻融后获取PM。纳米微泡表面修饰PM后,将UK缀合在PM上,最终过滤获得终产物PM@PLGA@P/H2-UK,同时也制备了 PLGA@P/H2、PM@PLGA@P/H2 和 PM@PLGA@PFH-UK 纳米微泡。采用同样的制备方法制备带有荧光标记的纳米微泡。 通过 冰冻透射电子显微镜(Cryoprecipitate transmission electron microscope,Cryo-TEM)、扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)观察PM@PLGA@P/H2-UK的形态结构。利用马尔文粒径仪检测PM、UK、PLGA@PFH、PLGA@P/H2、PM@PLGA@P/H2 和 PM@PLGA@P/H2-UK 的粒径、多分散指数(Polydispersity Index,PDI)及Zeta电位。使用荧光光谱仪测定DiO标记PLGA@PFH、PLGA@P/H2、PM@PLGA@P/H2 及 PM@PLGA@P/H2-UK 的激发波长和发射波长。通过SDS-PAGE凝胶电泳鉴定纳米微泡表面膜蛋白的完整性。使用人尿激酶型纤溶酶原激活因子检测试剂盒、总巯基含量检测试剂盒验证并计算UK的负载量。 研究结果 Cryo-TEM与SEM结果显示合成的PM@PLGA@P/H2-UK纳米微泡为均匀的球形“核-壳”结构;粒径均一,平均直径约为100 nm;Zeta电位约为-5.26 mV;PDI为0.555。荧光标记的纳米微泡的最大激发波长为460nm,最大发射波长为398nm。Western Blot验证了 PM@PLGA@P/H2-UK表面血小板膜蛋白的完整性,表明PM以涂层的方式成功修饰在PLGA@P/H2表面。PM@PLGA@P/H2-UK表面-SH和UK含量的变化证明了 UK与PM的成功结合。 研究结论 成功制备了具有PM涂层且负载有UK和H2的纳米微泡(PM@PLGA@P/H2-UK),并完成了相应表征。其粒径均一,形态规则,载药量符合实验预期。 第二部分 纳米微泡的的体外实验研究 研究背景 在血栓形成过程中,血管受损或凝血因子活化可导致血小板、纤维蛋白异常聚集,形成血栓。动脉血栓形成往往发生在高剪切应力的血管中,会阻塞血流或脱落至健康器官的血管中,导致致命的心血管疾病。动脉血栓主要由活化的血小板和纤维蛋白构成,其中,血小板起着重要的作用,这种血栓通常被称为“白色”血栓。在动脉血栓中,纤维蛋白主要以纤维束的形式存在。在血栓收缩过程中,血小板拉住纤维蛋白,压缩红细胞,导致红细胞从双凹细胞转变为多面体细胞。随着时间推移,机化的动脉血栓更致密,含有更多的纤维蛋白,血栓的孔隙更少,这导致病理性血栓的渗透性极低,可能会限制改善药物的进入,削弱了血栓对抗血小板改善和溶栓改善的反应性。有文献报道,由受损内皮细胞和活化血小板产生的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)在血栓部位上调,并进一步导致内皮细胞功能障碍和血小板活化,从而促进血栓增殖及血管闭塞。是以,清除过量的ROS将会是另一种新型的血栓改善策略。H2是一种安全有效的抗氧化剂,其在血栓改善中的研究相对较少,具有良好的发展前景。因此,开发新型药物递送系统将抗栓药物靶向递送至血栓部位并清除过量的ROS可以更安全、更有效地改善患者的溶栓效果。 研究目的 通过体外实验,验证PM@PLGA@P/H2-UK纳米微泡具有超声响应性、抗氧化作用、体外溶栓等效果。 研究方法 1.通过倒置显微镜观察PM@PLGA@P/H2-UK纳米微泡的超声响应性,并计算其H2释放量。 2.利用CCK-8检测不同浓度的PM@PLGA@P/H2-UK纳米微泡与人脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cell,HUVECs)和 Raw264.7 细胞孵育 12 h 后的细胞存活率。通过溶血实验考察纳米微泡的体外生物安全性。 3.使用过氧化氢(H2O2)含量检测试剂盒测定纳米微泡的体外抗氧化能力。 4.取小鼠全血和凝血酶孵育形成血栓后与不同纳米材料共孵育,评价PM@PLGA@P/H2-UK纳米微泡的体外溶栓效果。 研究结果 1.通过相变实验测试了纳米微泡的超声响应性,纳米微泡的直径随着超声波强度的增加而增大。PM@PLGA@P/H2-UK纳米微泡经超声爆破后,H2浓度最高可达1.1 ppm;而未经超声爆破的纳米微泡,最高H2释放量仅达0.5 ppm,证明了超声利用空化效应爆破纳米微泡,释放H2的可行性。 2.CCK-8及溶血实验证明,PM@PLGA@P/H2-UK纳米微泡具有良好的生物相容性。 3.PM@PLGA@P/H2-UK纳米微泡能够以浓度依赖性的方式有效清除H2O2。 4.体外溶栓的结果显示,当使用PLGA@P/H2+US、PM@PLGA@P/H2+US和PM@PLGA@P/H2-UK+US处理血凝块时,上清液中的纤维蛋白和血红蛋白吸光度(Optical Density,OD)明显增加,而仅使用US或仅使用UK处理的血凝块OD值未见明显增加。PM@PLGA@P/H2-UK+US组的溶栓效果最强。 研究结论 体外实验验证了 PM@PLGA@P/H2-UK纳米微泡具备良好的超声响应性,证实了其释放H2的可行性。该纳米微泡能够有效的清除H2O2,具有良好的体外溶栓效果与生物相容性。 第三部分纳米微泡的的体内实验研究 研究背景 心血管疾病是全球死亡的主要病因,严重威胁人类健康,且近年来患者逐渐年轻化,对社会带来了巨大的经济负担。血栓形成或血凝块的过度形成是造成心血管疾病的主要原因。这些血栓可导致血栓生成部位血流受阻(急性血栓形成)或易位至远端部位成为造成血流停止的栓子(血栓栓塞)。动脉血栓形成可能导致急性缺血性脑卒中、心肌梗死、下肢动脉闭塞、内脏动脉栓塞。一些血栓性疾病直到晚期才会出现明显症状,然而动脉血栓的早期诊断对其转归、疗效和预防至关重要。目前动脉血栓的诊断主要是依靠临床表现与影像资料,而动脉血栓的诊断、监控与防治,耗费了大量的资金和资源。临床干预旨在快速重建闭塞血管的血流,以最大程度地减少组织损伤。当前的抗栓改善分为药物改善与手术改善,抗栓药物包括抗血小板药物、抗凝剂和溶栓药。抗血小板药物和抗凝剂具有抑制或延缓血栓生成的作用,但对己形成的血栓无效。只有溶栓药才能主动或被动溶解血栓。手术改善包括机械取栓和导管溶栓。然而,目前动脉血栓的改善存在一些局限性,例如侵入性、辐射、潜在的致命性出血等副作用。因此,为了改善患者的预后,优化当前的溶栓技术具有重要意义。 研究目的 通过体内实验,证明PM@PLGA@P/H2-UK纳米微泡具有靶向性、ROS清除能力、体内溶栓能力及生物相容性。 研究方法 1.建立小鼠右侧颈动脉血栓模型。 2.通过鼠尾静脉分别注射DiO标记的PLGA@P/H2和PM@PLGA@P/H2-UK纳米微泡进入小鼠体内,循环1h后,取右侧颈动脉制作病理切片,进行纤维蛋白免疫荧光染色,然后使用激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscopy,CLSM)观察纳米微泡对体内血栓的靶向性。 3.将小鼠右颈动脉血栓模型随机分为4组(n=3):血栓形成组、PLGA@P/H2+US组、PM@PLGA@P/H2+US 组、PM@PLGA@P/H2-UK+US 组。改善后,取右侧颈动脉进行H&E染色,在光学显微镜下评估各组纳米微泡的体内溶栓效果。 4.取右侧颈动脉进行二氢乙锭(Dihydroethidium,DHE)染色,评估血栓组织的ROS水平,判断纳米微泡的体内抗氧化能力。 5.将PM@PLGA@P/H2-UK纳米微泡经尾静脉注入小鼠体内,在1天后进行血常规、血生化及重要脏器H&E染色以评估体内安全性。 研究结果 1.成功构建小鼠右颈动脉血栓模型。 2.在小鼠颈动脉血栓模型中,被PM包覆的纳米微泡显示出更强的荧光,因此具有更好的靶向性。 3.注射不同药物后,PM@PLGA@P/H2-UK组显著降低血管中血栓占比,体内溶栓效果最好。 4.通过FeCl3诱导产生的右侧颈动脉血栓及血管内皮细胞中检测出较强的DHE荧光,表明血栓部位产生大量的ROS。经过PM@PLGA@P/H2-UK纳米微泡改善后,血栓部位的ROS水平大量降低,提示PM@PLGA@P/H2-UK纳米微泡具有较好的抗氧化活性。 5.血常规、血生化及重要脏器H&E染色均证实该PM@PLGA@P/H2-UK纳米微泡具备良好的生物相容性。
研究结论 在动物水平成功建立颈动脉血栓模型,PM@PLGA@P/H2-UK纳米微泡富集在血栓部位,显著溶解颈动脉血栓,大大降低血栓部位的ROS生成,同时具有良好的生物相容性。
