氢气治疗骨关节炎，细胞凋亡和炎症信号通路研究
文章来源：admin发布日期：2021-06-04 16:31浏览次数：
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Lu, Hongwei et al. “Hydrogen (氢气) Alleviates Oste骨关节炎rthritis by Inhibiting Apoptosis and Inflammation via the JNK Signaling Pathway.” Journal of inflammation research vol. 14 1387-1402. 13 Apr. 2021, doi:10.2147/JIR.S297622
氢气治疗关节炎非常有价值，本研究从细胞凋亡和炎症角度开展研究，主要意义是寻找氢气效应的分子基础，但更重要的意义在于氢气对关节炎作用本身，特别是氢气对人类关节炎效果到底是否存在，这种效果和其他治疗药物的优劣，这才是使用氢气治疗关节炎的根本。不解决这些问题，氢气作用的分子机制有何意义，氢气对动物的关节炎研究有何价值。
骨关节炎是一种非常常见的疾病，会导致关节疼痛、残疾和社会经济负担增加。骨关节炎的发病机制与大量炎症和凋亡细胞因子密切相关。据报道，氢气具有选择性抗氧化作用，其中许多作用和JNK途径相关，如抗凋亡、抗炎和抗氧化特性。氢气是否通过JNK信号通路对骨关节炎有保护作用尚不清楚。本研究的目的是了解氢是否对软骨细胞有保护作用，并进一步探讨其可能的机制。
软骨细胞取自人软骨组织。用TBHP刺激细胞，用氢气处理。采用Western blot、RT PCR、免疫荧光和TUNEL法评价体外处理效果。建立了小鼠内侧半月板(DMM)不稳定模型，并用氢气处理。采用x射线成像、软骨细胞番红O染色、细胞凋亡TUNEL染色和免疫组化方法评价体内治疗效果。
我们的研究结果显示，氢可以抑制tbhp诱导的软骨细胞中的炎症因子(ADAMTS5和MMP13)和凋亡因子(cleaved caspase-3、细胞色素c和Bax)。氢可以抑制JNK信号通路的激活，而氢的作用可以被茴香霉素(JNK激活剂)消除。体内结果显示，氢可以下调p-JNK的表达和caspase-3活性片段的表达。
我们发现氢气可通过抑制JNK信号通路缓解人软骨细胞的凋亡和ECM降解。手术诱导的DMM小鼠模型中，氢气治疗可以延缓骨关节炎进展。
骨关节炎是一种不可逆的关节炎变性状态，可导致严重的不稳定的关节，其病理特征是关节软骨退行性，进行性软骨下硬化症，骨赘的发生，以及滑膜炎症作为最普遍的慢性关节炎类型，其对日常活动的影响在老年人中尤其突出。大量研究已经确定了一系列骨关节炎发展的影响因素，包括炎症、衰老、肥胖、创伤、关节变形、骨质疏松等。尽管如此，骨性关节炎的发病机制仍不清楚。氧化应激和炎症已被证明是骨关节炎进展的关键危险因素。此外，大量骨关节炎因子可引起氧化还原失衡，促进软骨细胞刺激导致炎症细胞因子的产生。目前临床治疗骨关节炎主要以改善关节功能、缓解疼痛为主。然而，该治疗方案并不能缓解骨关节炎的进展。因此，探索新的骨关节炎治疗策略是必要的。
氢气是一种无色无味的气体。它具有多种生物活性，包括抗炎和抗氧化特性。1975年，Dole等人发现97.5%的氢气可用于癌症治疗。Ohta S发现，2%浓度的氢气可以改善线粒体疾病，因为它可以迅速扩散到组织和细胞。Ohsawa等观察到吸入1-4% 氢气可以通过选择性减少细胞毒性氧自由基来显著减轻脑缺血再灌注损伤。
前期研究表明JNK信号通路可调控炎症和细胞凋亡。当受到TBHP(过氧化叔丁醇)等刺激时，JNK的激活会导致c-Jun的磷酸化。c-Jun降低了蛋白多糖的合成，增强了基质金属蛋白酶-13 (MMP-13)的产量。Gao等发现LncRNA MALAT-1可以通过JNK信号通路抑制细胞凋亡和软骨基质降解。Jiang等人发现Nesfatin-1抑制il -1β诱导的NF-κB、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)和Bax/Bcl-2信号通路的激活JNK通路的激活刺激了Bax、Cytochrome c、cleaved caspase-3等凋亡介质的产生。因此，抑制JNK通路的激活可能是一种很有前途的治疗策略。最近的一项研究表明，氢气可以通过降低MMP-13和增加II型胶原酶(Col II)的表达来抑制氧化损伤。但目前尚不清楚氢气是否通过JNK通路介导其在骨关节炎中的保护作用。
在本研究中，我们发现氢气在骨关节炎中发挥软骨保护作用，并在体内和体外条件下探索其潜在机制。在这里，软骨细胞暴露于过氧化叔丁醇(TBHP)体外诱导氧化应激。我们发现氢气可能通过JNK通路抑制过氧化叔丁醇诱导的软骨细胞凋亡和炎症。此外，茴香霉素激活JNK可消除氢气的抗凋亡和抗炎作用。因此，氢气通过JNK信号通路抑制细胞凋亡和炎症反应，减轻骨关节炎。我们的研究突出了氢气在骨关节炎中的治疗潜力，并探讨了氢气在软骨细胞中的抗凋亡和抗炎作用机制。
人类骨关节炎的组织采集和实验得到温州医科大学第二附属伦理委员会(伦理线:LCKY-2019-67)和育英未知儿童医院的批准，并遵循赫尔辛基宣言的指导原则。本研究的受试者均获得知情同意。
本实验取10周龄C57BL/6雌性小鼠45只，来自中国科学院上海动物中心。腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉后，用显微外科剪刀剪断内侧半月板的胫骨韧带建立骨关节炎模型。假手术组小鼠左膝关节也行不处理内侧半月板韧带的关节切开术。术后将小鼠随机分为三组(n = 15):假手术组、骨关节炎组(DMM)和骨关节炎组(DMM + 75% 氢气)。每天吸入气体1小时。
术后8周对小鼠进行影像学评估。使用x光机确定骨赘的形成、关节间隙和软骨表面钙化。
Safranin-O/Fast Green检测关节软骨破坏情况。光镜下观察小鼠软骨细胞及其周围组织的形态学变化。通过国际骨关节炎研究学会(骨关节炎RSI)的胫骨髁内侧和股骨内侧平台评分系统评估关节软骨的破坏情况。
在固定软骨细胞或软骨切片后，根据制造商的说明，使用原位细胞死亡检测试剂盒(Roche, Basel, Switzerland)在黑暗潮湿的房间进行TUNEL染色。接下来，用DAPI染色细胞核。荧光显微镜下检测凋亡细胞DNA链断裂阳性染色。
首先对膝关节进行4%多聚甲醛(PFA)固定、脱钙、石蜡包埋，并切成7个µm切片进行脱亲和复水化处理。然后，在37℃下，使用过氧化氢(3% v/v)和胰蛋白酶edta溶液(0.25%)对组织学切片进行30分钟处理。这些切片在37°C BSA(10%)中孵育60分钟后，在4°C用抗caspase-3和P-JNK的一抗处理24小时。然后，在第2天使用酶标第二抗体在4°C下切片孵育1 h。在image - pro Plus 6.0版辅助下完成图像分析，定量分析采用每组5个切片。
首先，我们从10例在温州医科大学附属第二医院接受全膝关节置换术的骨关节炎患者(男女各占一半，年龄54±8岁)中收集人类软骨组织，将其切成小块，用PBS冲洗3次。然后，用胶原酶II在37°C下孵育4 h。800 rpm离心6 min后，将消化后的软骨组织悬液放入烧瓶中进行组织培养。在37°C，软骨细胞在5% CO2气氛下，使用含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基培养。每隔一天更换一次培养基。我们使用胰蛋白酶传代培养人类细胞，直到达到80 ~ 90%的融合。
实验前，氢气储存在气瓶中。然后混合氢气、氧气和氮气，通过三路连接调整氢气浓度(6.25、12.5、25、50、75% (vol/vol)，用TRACE GC Ultra气相色谱法测定。每组中除去一定体积的氢气后，将剩余体积按空气中氮气和氧气的比例混合，即0.78:0.21。用TBHP预处理软骨细胞24 h，并将氢气导入培养细胞4 h。
按照制造商的说明，使用CCK-8试剂盒检测氢气对软骨细胞的细胞毒性。首先，将细胞以每cm2 50000个细胞的密度镀于96孔板中24小时，并与不同浓度的氢气(0、12.5、25、50和75%)孵育4小时。然后，在PBS中冲洗3次。最后，每孔加入10 mol/L CCK-8溶液2 h，在450 nm波长下用分光光度计观察光密度。
实验至少进行了三次。所得数据用平均值±SEM表示。数据通过GraphPad Prism(美国)进行分析。组间比较采用单因素方差分析，然后采用Tukey检验。P < 0.05的概率值认为有统计学意义。
氢气抑制小鼠DMM模型中骨关节炎的进展。这个结果最重要，三种比较，第一是正常情况，二是关节炎，有一些软骨消失，表现为红色变淡，氢气治疗后恢复正常。
氢气对tbhp诱导的人软骨细胞中细胞因子和凋亡相关蛋白表达的影响
骨关节炎是一种以长期疼痛和关节受限为特征的慢性关节退化疾病目前治疗骨关节炎的选择是早期应用非甾体抗炎药物(NSAIDs)，但它们仅能缓解临床症状。此外，它们还会导致一系列副作用，如心脏病发作和中风人工关节置换术仍然是骨关节炎晚期治疗的唯一选择。因此，一种能够阻止骨关节炎进展且副作用少的药物是骨关节炎的潜在治疗策略。最近，越来越多的关注集中在抗凋亡化合物，可能能够治疗骨关节炎而没有有害的副作用生化和生物力学事件诱导软骨细胞中ECM的凋亡和分解代谢和合成代谢之间的失衡在细胞和动物模型中，一些基因调控细胞凋亡的药物治疗已经显示了对骨关节炎发展的治疗作用因此，研究软骨细胞凋亡的潜在机制可能是治疗骨关节炎的一种潜在途径。
氧化应激是软骨细胞凋亡的主要过程。当TBHP刺激软骨细胞时，它们产生ROS，如超氧阴离子(O2−)、氢气O2和羟基自由基(OH);这导致线粒体损伤并最终导致细胞凋亡越来越多的研究发现过量的ROS会导致软骨的降解和软骨细胞的凋亡。因此，降低ROS的产生可能是治疗骨关节炎的有效策略。有趣的是，氢是一种抗氧化化合物。
氢是自然界中最轻的元素，是最简单和最丰富的元素许多研究报道了氢气在几种疾病中的抗炎、抗凋亡和抗氧化作用。他们证明吸入4%氢气是一种安全有效的治疗人类疾病的方法。氢气因其制备简单、安全性高、渗透性强、便于携带而引起了研究人员的注意。16Peng Guan等发现氢气通过JNK信号通路改善了慢性间歇性缺氧(CIH)诱导的肾损伤Zhao等发现氢气通过阻断c-Jun n -末端激酶(JNK)-MAPK.36，减轻内质网应激和心肌细胞凋亡Wu等发现，氢气通过抑制新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的凋亡和炎症反应而减轻脑损伤37Chen等发现吸入氢可以改善小鼠脊髓损伤后脊髓神经元的凋亡和氧化应激JNK通路是经典的促凋亡通路，已被证明在骨关节炎发展过程中调节软骨细胞凋亡中发挥关键作用。既往研究表明，尿石素A、人参皂苷、木犀草素等药物通过抑制JNK信号通路的激活来保护软骨细胞。因此，靶向下调JNK磷酸化可能被认为可以有效治疗骨关节炎。
因此，在本研究中，我们通过JNK信号通路探索氢气对人软骨细胞的抗凋亡能力。在tbhp处理的人类软骨细胞中，氢气明显抑制JNK的磷酸化。由于JNK通路的活性被抑制，Bax和cleaved caspase-3等凋亡因子的产生被下调，从而改善了骨关节炎的进展。总的来说，我们的数据表明氢气在骨关节炎发展过程中具有抗凋亡活性，这在thbp处理的软骨细胞上得到了证实，JNK通路可能参与了其作用机制。因此，氢气的作用是明显的。此外，与假手术组相比，DMM组关节间隙缩小，ECM降解，软骨严重受损，蛋白多糖严重缺乏。经氢气治疗后，上述症状均得到改善，小鼠DMM模型骨关节炎RSI评分降低。软骨的TUNEL染色和cleaved caspase-3的IHC染色显示，氢气可以缓解软骨的凋亡。此外，氢气参与JNKs信号通路，改善了骨关节炎进展。综上所述，这些结果和前期研究结果表明，通过抑制JNK通路的激活，氢气对骨关节炎的发展有改善作用(图8)。
示意图揭示了氢气通过JNK通路的参与以及在骨关节炎进展中的潜在保护作用。
有趣的是，人们研究了氢在不同浓度下对各种疾病的治疗效果。本研究采用高氢气浓度(6.23-75%)研究氢气对骨关节炎的保护作用。
综上所述，发现氢气通过使JNKs信号通路失活来减轻人软骨细胞的凋亡反应和ECM降解。同时，在手术诱导的DMM小鼠模型中，氢气治疗对骨关节炎的发展也有重要作用。数据表明氢气具有抗骨关节炎保护活性。
