研究目的:创伤性脑损伤(TBI)是影响人类健康的重要疾病,具有高病死率和高致残率的特点。统计表明,TBI是45岁以下人群的主要死亡和致残原因。由于罹患人群以青壮年为主,给个人、家庭及社会造成了更大的经济负担。目前,TBI缺乏有效的治疗方法,改善预后十分困难。寻找有效的神经保护剂,是急需解决的医学难题之一。氢气作为一种新型医学气体分子,已应用于治疗多种疾病,并取得了良好的效果。氢用于医疗目的具有很多明显的优势:(1)氢气可以选择性清除氧自由基,不与具有重要信号作用的活性氧发生反应,不会破坏机体的内源性抗氧化防御系统。(2)氢气可以轻易穿过血脑屏障,透过亚细胞结构。(3)氢气与羟自由基结合生成水,代谢产物安全无毒,可通过呼吸将多余的氢气排出体外。miR-21在TBI的疾病过程中占有重要的地位。课题组的前期研究发现,miR-21是唯一一个在创伤后6h、24h、48h和72h均有两倍以上表达量变化的miRNA。前期研究还证实,TBI后miR-21在脑组织神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和脑微血管内皮细胞的表达水平均升高,上调脑组织miR-21表达水平可以改善学习、记忆和运动功能。此外,miR-21还具有抑制细胞凋亡,减少血脑屏障渗漏,促进血管生成修复的作用。更重要的是,氢可以影响脑组织中miR-21的表达水平。
本研究旨在证实氢对TBI后神经功能缺损、前庭功能障碍、创伤灶体积、血脑屏障渗漏和脑水肿的治疗作用,进一步研究氢对TBI后神经突起再生、神经元凋亡和氧化应激反应的影响,探讨miR-21是否参与并调控了上述氢对TBI的神经保护机制,为TBI的临床药物研究及治疗新策略提供理论依据。方法:第一部分探讨氢气对TBI动物模型的神经保护作用。应用CCI模型制备大鼠TBI模型,部分TBI大鼠给予氢气吸入治疗。应用改良神经功能缺损评分(mNSS),评价氢气治疗对TBI大鼠的神经功能缺损和行为学功能的改善作用;应用平衡木实验,评价氢气治疗对TBI大鼠平衡能力及前庭功能的改善作用;通过行甲酚紫染色结合图象分析技术测定脑损伤体积百分比,评价氢气治疗对TBI大鼠脑损伤灶的修复作用;通过对大鼠脑组织含水量的检测,评价氢气治疗对TBI大鼠脑水肿的改善作用;通过EB渗出量的测定,评价氢气治疗对TBI大鼠血脑屏障渗漏的改善作用;通过检测抗氧化物酶SOD和CAT的活性以及氧化产物MDA和8-iso-PGF2α的水平,评价氢气对TBI大鼠氧化应激的抑制作用。第二部分探讨miR-21是否参与了氢气对TBI动物模型神经保护作用的调节。通过CCI模型制备大鼠TBI模型,部分TBI大鼠接受氢气吸入治疗,部分TBI大鼠通过侧脑室注射给予脂质体携带的miRNA-21 antagomir干预。应用qRT-PCR技术检测TBI后0至3天miR-21的表达水平变化。再应用上述方法评价神经功能缺损、平衡能力及前庭功能、脑损伤体积、脑水肿程度、血脑屏障渗漏和氧化应激指标,以探讨miRNA-21是否影响氢气对TBI的保护作用。第三部分探讨富氢液对TBI细胞模型的神经保护作用。采用划痕损伤细胞方法制作原代神经元细胞TBI模型,部分神经元给予富氢液培养干预。应用MTT法,分析富氢液对原代神经元TBI模型细胞活力水平的改善作用;应用LDH法,分析富氢液对原代神经元TBI模型细胞受损水平的改善作用;通过神经元特异性标记物βⅢ-Tubulin的免疫荧光染色,对神经突起分支及突起长度进行定量分析,评价富氢液对原代神经元TBI模型细胞神经突起的修复作用;应用Western blot法测定各种凋亡相关蛋白,应用TUNEL法检测原代神经元的凋亡阳性细胞百分比,评价富氢液对原代神经元TBI模型细胞凋亡的抑制作用;通过检测抗氧化物酶SOD和CAT的活性以及氧化产物MDA的水平,评价富氢液对原代神经元TBI模型氧化应激的抑制作用。第四部分探讨miR-21是否参与了富氢液对TBI细胞模型神经保护作用的调节。采用划痕损伤细胞方法制作PC12神经元TBI模型,部分TBI细胞模型给予富氢液干预,部分TBI细胞模型给予miRNA-21 antagomir干预。应用qRT-PCR技术检测各组细胞模型miR-21的表达水平差异。评价富氢液对PC12神经元细胞活力、细胞受损水平、神经突起修复、细胞凋亡和氧化应激指标的影响,并探讨miRNA-21在富氢液对TBI的保护中的作用。结果:在动物实验中,(1)氢气可改善TBI后神经功能的缺损;(2)氢气可改善TBI大鼠平衡能力和前庭功能;(3)氢气可显著减少脑损伤体积百分比;(4)氢气可减少TBI后脑水肿和血脑屏障渗漏;(5)氢气可改善TBI后的氧化应激。在动物实验中,(1)氢气上调TBI大鼠miR-21的表达,miR-21 antagomir可以下调miR-21的表达。(2)miR-21 antagomir可以减弱氢气对神经功能缺损的保护作用。(3)miR-21 antagomir可以减弱氢气对平衡能力和前庭功能的保护作用。(4)miR-21 antagomir可以减弱氢气对脑损伤体积的保护作用。(5)miR-21 antagomir可以减弱氢气对脑水肿和血脑屏障渗漏的保护作用。(6)miR-21 antagomir可以减弱氢气对氧化应激的保护作用。在细胞实验中,(1)富氢液可以改善原代神经元细胞活力;(2)富氢液可以改善细胞受损水平;(3)富氢液可以促进神经突起数量增加和长度的延长;(4)富氢液可以抑制神经元的凋亡;(5)富氢液可以抑制氧化应激。在细胞实验中,(1)富氢液可以提高PC12细胞模型中miR-21的表达水平,此作用可被miR-21 antagomir拮抗。(2)miR-21 antagomir可以减弱富氢液对PC12神经元细胞活力的保护作用。(3)miR-21 antagomir可以减弱富氢液对PC12神经元细胞受损的保护作用。(4)miR-21 antagomir可以减弱富氢液对PC12神经元神经突起再生的保护作用。(5)miR-21 antagomir可以减弱富氢液对PC12神经元凋亡的保护作用。(6)miR-21 antagomir可以减弱富氢液对PC12神经元氧化应激的保护作用。
结论1、氢气在细胞实验和动物实验这两个水平上对TBI模型均具有显著的神经保护作用,可以明显改善神经缺损和平衡功能,减少创伤灶体积,抑制脑水肿和血脑屏障渗漏,改善神经元细胞活力及受损水平,促进损伤神经突起再生,抑制氧化应激和细胞凋亡。2、miR-21参与了氢气对TBI保护作用的调节,氢气在细胞实验和动物实验中通过调节miR-21的表达水平实现对TBI的保护作用。3、氢气可以作为TBI后继发性脑损伤的潜在治疗手段,本研究为更加深入的氢分子治疗机制方面的研究奠定了一定的前期实验基础。
