一、研究背景与目的类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以关节滑膜慢性炎症为特殊表现的系统性自身免疫性疾病。RA在欧美国家发病率高达0.5-2.0%,而在我国其发病率也达到了0.32-0.38%。RA发病机制复杂,受多种因素的影响,这些因素导致机体免疫调节失衡和过度的炎症反应,从而引起关节结构的破坏。氧化应激(Oxidative stress,OS)参与了RA的发病过程,对RA病理机制影响较大。RA的氧化损伤主要由ROS和RNS所致,它们是机体在新陈代谢过程中生成的有害自由基。OS可引起RA患者体内的氧化标记物如丙二醛(malondialdehyde,MDA)、8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-hydroxy-2’-deoxyguanosine,8-OHdG)、蛋白羰基(protein carbonyl)等水平升高。OS还能激活经典的核转录因子-κB(NF-κB)信号通路。OS也可以改变谷胱甘肽(GSH)的氧化还原状态,促使NF-κB抑制因子(IκB)失活,进而异位到胞核内。氢气(Hydrogen,H2)是自然界广泛存在的无色、无味的气体。其具有选择性抗氧化作用,可选择性中和ROS和RNS。但是,氢气具体选择性抗氧化作用机制目前仍不清楚,其影响发挥枢纽调节作用的上游分子也并不了解。和炎症关系密切的核转录因子-κB(Nuclear factor kappa B,NF-κB),与细胞增殖、凋亡紧密联系的丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPKs),与成纤维细胞强效的趋化因子-转化生长因子(Transforming growth factorβ1,TGF-β1),这些都是目前知道的氢气抗氧化应激途径中的发挥重要作用的因子。Keap1/Nrf2/ARE信号通路是机体在抗氧化应激反应中的重要通路,是近几年抗氧化研究领域中的热点通道。氢气可以通过Nrf2发挥其选择性抗氧化的作用,但是氢气是通过哪种途径诱导Nrf2产生效应呢,这个具体的机制还是目前氢气医学研究的热点与难点。因为氢气的选择性抗氧化作用,所以氢气也被应用于类风湿关节炎治疗上。国外学者报道了在类风湿关节炎患者中,氢气治疗后关节活动度评分(Disease activityscore-28,DAS28)和血液中的炎症性指标都有了明显的改善。但是氢气对于成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like synoviocytes,FLS)的抗氧化作用如何,及其对FLS增殖、凋亡及其相关的信号的信号通道的影响未见报道。此外,氢气通过何种信号通道对FLS发生作用也未见报道,其与MAPK、NF-κB等信号因子有无关系尚不明确。而氢气作用于氧化应激疾病中的重要的抗氧化信号通道Nrf2,是否也参与了其对RA疾病的抑制过程也需要进一步研究。
二、研究内容与方法我们利用异种II型胶原乳剂,在小鼠背部、尾部多点皮下注射,建立CIA小鼠模型。通过形态学观察小鼠足部、尾部的表现,以评价建模的好坏。通过AI评分、形态学和病理学观察,以评价氢气对CIA小鼠模型类风湿病情缓解的情况。选用MH7A类风湿滑膜成纤维细胞,通过双氧水处理细胞,制造体外氧化应激的环境。并予以富氢培养基干预,通过观察细胞增殖的情况,抗氧化应激系统(SOD和GSH)表达、DNA氧化损伤指标(8-OHdG),来判断氢气对FLS氧化应激反应的影响。同时,我们检测了MAPK、NF-KB和TGF-β1,以评价MAPK通道和TGF-β1对FLS氧化应激反应有无影响。选用从儿童皮肤中分离的成纤维细胞,通过双氧水处理细胞,制造体外氧化应激的环境。并予以富氢培养基干预,通过观察细胞增殖的情况;利用Annexin V/PI检测早期细胞凋亡和坏死的结果;借助双氢溴乙啶(Dihydroethidium,DHE)和2’7’二氯氢化荧光素乙二脂(2’,7’-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)观察细胞内活性氧的生成情况;通过Elisa分析氧化产物MDA、抗氧化应激系统(SOD和GSH)表达、DNA氧化损伤指标(8-OHdG)。从而判断氢气对成纤维细胞氧化应激反应的影响。同时,我们利用Western blot分析Nrf2、CATA、γ-GCS的蛋白表达的情况,以评价Nrf2信号通道对成纤维细胞的氧化应激反应有无影响。
三、研究结果与结论在此项研究中,我们得到了以下结果:1、病理结果显示正常对照组小鼠标本无滑膜细胞增殖、炎性细胞浸润、血管翳产生以及骨侵蚀等表现;CIA模型组有明显增生的滑膜组织、炎性细胞的浸润、血管翳的产生以及部分骨质受到侵蚀;富氢水治疗组则表现出少量增殖的滑膜细胞,中性粒细胞有少量浸润和轻微的骨侵蚀表现。病理评分提示富氢水治疗组较CIA模型组小鼠在各项指标病理评分上明显降低。2、肉眼观察发现,CIA组小鼠在30天(疾病早期)的时候有部分小鼠前足出现红肿,后发展到后足。在40天(疾病中期)时候肿胀出现高峰。而富氢水治疗组的小鼠肢体红肿的程度出现的时间晚于CIA模型组,其肿胀的程度也明显小于CIA模型组。CIA模型组小鼠在14天左右(即疾病早期),开始出现关节炎指数(Arthritis index,AI)升高;在21天,达到峰值,后逐渐下降。富氢水治疗组AI指数升高的时间和CIA组一致,但升高的幅度明显小于CIA模型组小鼠。3、对于MH7A细胞存活率用MTT法检测的结果是:与对照组相比,在加入H2O2后细胞增殖显著增强,并随时间延长,增殖速度加快。而加入氢气后细胞增殖受到了明显的抑制。4、采用Elisa检测方法发现,类风湿滑膜成纤维细胞在应用双氧水处理后8-OHDG升高了,抗氧化系统中的SOD和GSH降低了。在加入富氢培养基以后,减少了氧化产物8-OHDG的含量,增加了SOD和GSH含量。同时发现,氢气抑制了MAPK、NF-κB和TGF-β1的表达。5、对于成纤维细胞,术后24h结果提示双氧水(H2O2)处理造成氧化应激模型组,与其他各组相比较,有较高的凋亡发生率。加入氢气组自发凋亡率和H2O2处理组相比有所下降。6、活性氧检测提示经H2O2处理的成纤维细胞内活性氧水平明显升高,经氢气处理后,可以显著降低细胞活性氧水平。采用Elisa方法检测发现,细胞在应用H2O2处理后8-OHDG和MDA升高了,GSH和SOD降低了。而加入富氢培养基后可以减少氧化产物8-OHDG和MDA含量,增加GSH和SOD含量。7、采用western blot检查发现,加入H2O2后成纤维细胞Nrf2和γ-GCS降低,CATA也降低了。而加入氢气以后Nrf2和γ-GCS恢复正常,CATA水平也升高了。通过上述研究结果,我们证实氢气通过抑制机体过度的氧化应激反应,可以有效的抑制RA疾病的发生。氢气可以激活体内的抗氧化系统,对MAPK、NF-κB和TGF-β1的表达有抑制作用。同时也激活了Nrf2信号通道。因此,氢气调节RA的氧化应激的作用机制也是非常复杂的。
