哺乳动物代谢氢气的同位素研究证据！

这是一项是关于氚标记方法示踪哺乳动物细胞代谢氢气的研究，1953年发表在ARCH BIOCHEM ANDBIOPHYS，论文作者Grant N. Smith(格兰特·史密斯)等来自美国通用电气公司放射生物学部。
 

Smith G N , Emerson R J , Temple L A , et al. The oxidation of molecular tritium in mammals[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 1953, 46(1):22-30.
 

氢气生物学效应研究，今天已经受到广泛关注。但氢气在动物和人体内的代谢仍然存在疑问，这非常不利于对氢气生物学效应的全面理解。这一沉寂的历史文献，从放射性标记角度，给出了关于哺乳动物细胞代谢氢气的重要线索，非常值得重视。由于这一研究提供了氢气在大鼠这种高等动物体内代谢的重要线索，应该成为氢气生物医学的最经典支持文献。所有氢生物医学研究者都应该认真阅读学习。
 

该研究小组曾经用氚标记氢气研究发现，进入身体内的氢气能被肠道和土壤内常见细菌氧化为水进入有机体。研究有助于理解氚进入环境的途径，也说明氚标记研究微量氢气在生物体系代谢的可行性。氢气参与生物氢化反应，但受检测技术限制，浓度必需在较高情况下才能分析(50年代的检测水平)。但比较明确的是，氢气是某些酶催化反应的特异性抑制剂(见1950年Stephenson Marjory主编Bacterial metabolism第三版)。因为有许多因素不支持氢气直接参与生化反应过程，因此需要对氚的生化过程进行确定性研究。氚标记技术给氢气的痕量分析提供了研究可行性。
 

这一研究是用痕量氚气分析方法研究氢气能否在哺乳动物体内被氧化固定。由于肠道内细菌是动物体内氢气代谢的重要因素，所以肠道组织作为被观察目标之一。研究有三方面内容，1)肠道细菌代谢氢气的作用。从肠道内分离出细菌，观察对氚气氧化的作用。2)组织匀浆对氢气的氧化作用。各种哺乳动物组织匀浆对氚气的氧化作用。3)整体动物研究不同组织对氢气的氧化作用。把动物暴露在氚气环境下，分析不同组织氚标记量，确定组织对氚气的固定作用。
 

研究方法
 

本研究氚暴露四种情况：肠道细菌暴露，大鼠组织暴露，肺呼吸含氚气体暴露，整体动物含氚气体暴露。后面是具体方法，仅供专业人员阅读。
 

细菌从肠道内分离，采用标准细菌学程序确定类型。制备细菌悬液，暴露在氚气条件下，分析氚标记活性。
 

哺乳动物组织匀浆用0.1M磷酸缓冲液pH7.5稀释为5%。在无菌条件下采集组织，在制备匀浆和氚暴露过程都持续保持无菌条件。暴露最后所有匀浆都进行细菌污染的检测。只有细菌检测阴性的组织匀浆才符合要求。动物组织匀浆的暴露实验设施和细菌暴露实验类似。经过暴露后，组织用干燥箱60°C真空干燥24小时。干燥样品进行燃烧，分析干燥蒸发的水内氚活性。其他部分在10度条件下真空蒸发，采集水分进行放射性分析。
 

整体动物氚固定比例研究使用大鼠，将动物暴露在含有氚气的装置内(图1是吸入和图2是整体暴露)。

图1 通过呼吸暴露氚气装置。
 

该装置整体为闭合系统，含有5个部分。分别为氚泵(A)、干燥管(B1，B2和B3)，有连续记录装置的电离舱(C, D, E)，一个双向阀连接的气管插管(G和H)、一个二氧化碳吸收舱(I)和氧气注入口(J)。(不理解的是，氚泵的工作原理，如何保持氧气进入系统内。)
 

氚泵的设计是下部瓶内氚用上部瓶内水进行替换，水下流进入下瓶，氚气进入上瓶。当上部瓶水全部流下，进行上下转换，重复上一程序。气体在B1干燥管干燥，干燥剂为高氯酸镁。(无水高氯酸镁，呈白色多孔颗粒，具有强烈的吸水性，是碳、硫、氢、氧、氮等气体分析仪器的理想干燥剂。)
 

干燥后的气体经过电离舱(C)耦合微微安培计(D)和Esterline-Angus图表记录器(E)。随后进入另外一个干燥管(B2)和双向阀(G)，这一装置能让实验动物安需吸入管路内气体。压力计(F1和F2)在双向阀两侧，能观察气压在动物呼吸过程中的波动。动物呼出的气体经过干燥管(B3)和二氧化碳吸收舱(I)净化。从注氧空(J)注射氧气补充因二氧化碳吸收导致的气体缺口，经过管路输入气体舱的上部瓶内(A)。
 

动物用戊巴比妥钠麻醉后气管插管。用上述装置经过完全氚气暴露后，处死动物用绞肉机把动物绞碎，组织放在250毫升25% KOH溶液摇晃4小时，这个过程收集释放出的气体经过微燃烧装置，燃烧后的水分析氚含量计算溶解在组织内的氚气。进入燃烧装置前，气体先通过一个干冰把氚水冷凝。
 

0.5%氢气和99.5%氧气混合气用于携带氚气进入燃烧装置，KOH消化组织内氚代表身体水和有机物内氚化合物含量。
 

动物整体暴露装置也是一个密闭系统，其中经过动物呼吸过的气体进行持续循环净化，氚气水平和气压维持稳定(图2)。
 

氚气从采样球(A)进入系统(B)。经过样本管的气体经过干冰脱水(C)脱水银蒸汽。气体通过气密循环泵(D)输入到电离舱，这里有Beckman微微安培计和Esterline-Angus表记录仪(我理解类似打印机)。这个组件能测定循环系统中氚的水平。此后气体经过另一个干冰除水装置(C)，气体进入暴露舱前进行压力测定。
 

暴露舱是一个璐彩特(聚甲基丙烯酸甲酯)盒，完全浸在在25°C恒温水中。排除气体通入二氧化碳吸收管，经过饱和氢氧化钾棉球清除动物呼吸产生的二氧化碳，然后气体通过两个高氯酸镁干燥舱干燥处理，通过给系统补充氧气和氚气，维持稳定的气压和氚含量，泵系统足够在几分钟内完成气体完全循环。
 

暴露结束后用空气冲洗系统大约20分钟。此时氚分析显示没有氚气存在于系统内。将动物取出后处死。动物组织匀浆后用Bidwell-Sterling进行苯蒸馏。蒸馏后成分用真空干燥去除苯和水分。样本进行焚烧，产生的水进行氚含量分析代表有机物结合氚。苯蒸馏出的水和石油混合去除苯，水层离心分离后测定氚，代表身体中水的氚含量。

图2 整体动物氚气暴露舱。
 

研究结果
 

肠道细菌固定氚气为氧化氚(水)的能力很强，这和过去研究结果一致，说明研究方法稳定性好。研究中发现乳酸粪链球菌Streptococcus faecalis氧化氢气的能力很强，这也是著名的肠道有益菌。
 

(放射性活度是指放射性元素或同位素每秒衰变的原子数，目前放射性活度的国际单位为贝克勒(Bq)，也就是每秒有一个原子衰变。放射性活度的国际单位制单位是贝可勒尔(Bq)，常用单位是居里(Ci)。1Ci=37GBq)
 

这里研究发现氚被氧化固定比例低于1%，各种组织匀浆氧化固定氚的比例见。
 

表1 不同组织匀浆固定氚的能力。(重点)
 

显然大场组织由于存在细菌，代谢能力超强。其他组织一般都没有氧化氚的能力，但是脾脏的氧化固定能力非常强，达到了大肠的6%左右。经典的观点认为哺乳动物组织并没有代谢氢气的作用，这样高比例的代谢必须引起我们足够的关注。小肠、肾脏和肌肉也有相对强的代谢能力，而脂肪、大脑和肝脏等作用几乎可以忽略不计了。这个研究再次证明，大肠内细菌是代谢利用氢气的最主要部位。
 

表2.消化道切除对氚标记的影响。
 

为了进一步验证大肠细菌是固定利用氢气最重要部位的假说。研究进一步采样整体动物进行实验。通过气管插管给动物吸入含氚气空气，有正常动物，也有切除胃肠道的动物(厉害!)，研究结果见表2. 全身暴露和肺呼吸暴露的无明显差别，预先3天口服抗生素会产生明显影响(表3)。
 

讨论
 

过去研究发现，含有氢化酶的细菌能氧化环境中痕量氚气分子为氧化氚(氚水)。由于氚浓度非常低，放射剂量比较小，放射损伤不足以影响细菌的正常代谢。氚浓度是最重要的反应速度影响因素。因为放射性检测敏感性高，这些研究能用氚测定能研究其变化，但同样变化的氢气和氘气因为检测信号敏感度因素而无法检测氘。
 

正常情况下大鼠肠道内细菌具有氧化氚气的能力，这一研究结果发现，肠道内不同种群的细菌氧化氚气的能力有较大差异。研究结果在表1中。这一结果也说明，肠道细菌是氧化氚的主要因素。在脾脏内出现比较大的氧化代谢，这无法用细菌代谢来解释，也无法给出合理的解释。虽然许多动物组织在制备过程会受到细菌污染，在比较短时间细菌可以大量繁殖。本研究似乎难以用细菌污染来解释，例如大肠杆菌和普通变形杆菌是最常见的肠道微生物，但假单胞菌是脾脏组织中常见的污染菌。更重要的是，脾脏组织匀浆中细菌的数量很少，也不足以影响氚的氧化固定。一般情况下，动物组织匀浆中细菌无法检测到，氚固定也非常低。这些结果都有可能受到氢氚物理交换反应的影响。
 

整体动物插管吸入氚气的结果见表2。肠道切除手术对氚保留的显著影响再次证明动物肠道细菌是固定氚的主要因素。实验结果发现存在明显的个体差异，原因可能是本研究没有选择在品种、体重和年龄完全一致的实验动物，这些动物的肠道菌群存在比较大的差别(那个时候的实验要求和现在很不一样?)。但是消化道切除手术的动物仍然都出现了一致的改变。这更符合肠道菌群是动物氧化固定氚气的主要因素这个假设。
 

切除胃肠道的动物，大肠内细菌显然也会被去除。关于肠道菌固定氚的推论也有更进一步的证据见表3。
 

表3 抗生素对动物固定氚能力的影响。
 

采用抗生素处理可影响肠道菌的增殖和代谢。本研究发现，暴露氚气前用抗生素处理，能显著抑制氚固定数量，这从另一个方面证明肠道菌群在氚固定中的重要地位。
 

但是细菌数量的下降和氚固定的改变没有明显的相关关系，使用抗生素可将动物大便中细菌数量降低到正常值的1%，但氚固定减少的比例只有50%左右。数量和种类都是影响氚固定的重要因素，所以单纯细菌计数不能直接反应能固定氚的细菌类型。
 

本研究虽然证明肠道菌是代谢氢气的重要因素，但是并不能否定哺乳动物细胞本身能代谢氢气，尤其是发现抗生素处理大幅度抑制细菌后氚标记仍然保留50%。肠道切除后仍然存在有3%的氚标记存在。更直接的研究证据是发现脾脏能大量氧化固定氚气，而小肠组织，肾脏，心脏、肌肉和大脑也具有比较强的固定能力。显著超过肝脏、胃、皮肤和脂肪固定氚的能力。