东方肝胆外科医院：氢盐水对肝切除术后肝功能保护研究
作者：东方肝胆外科医院博士研究生李东宇，导师杨广顺教授
对于原发性肝癌及肝转移瘤患者来说，肝切除术是经典且有效的改善手段，可以显著改善患者的预后，但同时也为患者带来了围手术期风险。相对于局部肝切除术而言，行扩大肝切除术的患者术后并发症的发病率和死亡率均较高，而有慢性肝病的患者手术风险更高。但是，随着对肝脏解剖认识的不断加深、外科技术的进步和围手术期监护水平的提高，扩大肝切除的手术指征在拓展，并且也取得了一定的效果。尽管如此，行扩大肝切除术后仍不可避免的会出现一些严重的并发症，肝功能衰竭就是其中之一，其死亡率高达70-80%。扩大肝切除术对肝功能的损伤包括了物理损失和缺血再灌注损伤，如何对接受扩大肝切除术的患者进行有效的肝功能保护是临床上比较重视和关心的问题。
针对缺血再灌注损伤机制，目前研究证实有保护作用的药物主要分为：自由基清除剂、钙离子拮抗剂、炎性细胞因子抑制剂、微循环改善药物等。近年来，氢气抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用逐渐被广大学者所重视，大量的实验证据表明，氢气可以通过对抗氧自由基，减轻ROS系统对细胞的损伤，减少细胞凋亡，从而有效地保护细胞，具有抗氧化、抗炎、抗凋亡的作用。本课题中，我们将首先建立猪70%扩大肝切除模型，并评价其安全性及临床模拟性;然后将在确认氢生理盐水对猪扩大肝切除术后肝脏功能的保护作用的基础上，通过测定几种炎性细胞因子水平、几种凋亡相关蛋白活性及转录因子水平等，以进一步探讨氢生理盐水在对猪扩大肝切除术后肝功能的保护作用方面亚细胞水平及信号转导途径的机制。
第一部分、猪70%扩大肝切除模型的建立
目的：建立猪70%扩大肝切除模型，并评估其安全性及临床模拟性。
材料和方法：6只巴马小型猪，体重在25.30kg，在全麻条件下行70%肝脏切除术，术中给予全肝门阻断。监测术中生命体征情况，记录术后7天存活率，检测术前及术后第1、2、3、5、7天的肝功能(TBIL、ALE、AST)及血红蛋白(HGB)变化。
结果：术中生命体征平稳，术后7天存活率100%，无严重并发症。术后TBIL显著升高(P<0.05)，术后第3天到达峰值，之后逐步恢复。ALT，AST在术后5日内升高显著(P<0.05)，术后第1日达到峰值，之后逐步恢复。监测血常规HGB未见明显贫血改变。
结论：猪70%扩大肝切除模型安全稳定，具有较好的临床模拟性，可用于扩大肝切除术后肝损伤的研究。
第二部分、氢生理盐水对猪扩大肝切除术后肝功能的保护作用及机制研究。
目的：研究氢生理盐水对猪扩大肝切除术后肝功能的保护作用，并从抗氧化、抗炎、
抗凋亡及肝再生等方面探讨其相关机制。一
材料和方法：12只巴马小型猪，体重在25.30蚝，随机分为70%肝切除+生理盐水对照组(Ns组，n=6)和70%肝切除+氢生理盐水实验组(H2组，n=6)，均在全麻条件下行70%肝脏切除术。氢生理盐水干预方案：行扩大肝切除术，并给予全肝门阻断。解除肝门阻断后即经胃网膜右静脉置管，给予氢生理盐水250ml静滴，之后术后第1、2、3d均经胃网膜右静脉给予氢生理盐水250ml。NS组以等量生理盐水作为对照。观察两组的7d生存率，术前及术后第1、2、3、5、7天的肝功能(TBIL、ALT，AST)及血常规(WBC、HGB)变化。术后第7d处死动物，观察其肝脏病理改变(光镜及电镜)，用相应的检测试剂盒分别测定肝组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)，过氧化氢酶(CAT)含量。用ELISA法检测IL.6、TNF.a、IL.1 13等炎性因子的血清水平，用Real—timePCR法检测肝组织中炎症信号相关分子P65的mRNA水平的变化。免疫组化p65染色观察肝组织炎性改变，ki67染色观察肝细胞增殖情况。用Western Blot法测定BCL-2、PARP等凋亡相关蛋白的表达水平，用Western Blot法测定p65、IKBa、IKK Q、IKK 13等分子的表达水平。
结果：
1、7d生存率：两组在体重、手术时间、肝门阻断时间、麻醉时间、术中失血量等方面的差异无统计学意义。两组的7d生存率均为100%。
2、肝功能及血常规变化：与NS组相比，H2组TBIL术后第1至7d均显著下降，TBIL同样在术后第3d达到峰值，但峰值显著下降;与Ns组相比，H2组ALT，AST在术后第1至7d均显著下降，同样在术后第1日达到峰值，但峰值显著下降。
3、光镜下病理改变：NS组术后7d可见肝细胞变性并伴有炎性细胞浸润，肝窦内皮剥脱、肝窦结构紊乱，汇管区门静脉内皮损伤等均较明显：与NS组相比，H2组术后7d肝细胞肿胀、变性较轻，门管区静脉内皮损伤不明显，肝小叶结构无明显紊乱。
4、电镜下超微结构改变：NS组术后7d可见细胞核固缩反应，并可见凋亡小体形成，线粒体出现空泡，线粒体膜扩张、嵴消失，胞浆内空泡形成，。与NS组相比，H2组术后7d细胞结构基本完整，未见明显染色质聚集，线粒体改变不明显，未见明显凋亡小体：
5、肝组织氧化应激的检测：与Ns组相比，H2术后可见组织MDA含量明显降低，SOD及CAT含量明显升高。
6、血清中IL-6、TNF-a、IL.1 13等炎性因子的变化：与NS组相比，H2组IL.6、TNFa、IL.1 13表达水平明显降低(P<O.05)。
7、免疫组化染色：p65染色显示，与Ns组相比，H2组术后7天p65胞浆着色减弱，提示炎性反应可能减轻。ki67染色显示，与Ns组相比，H2组术后7天ki67染色阳性染色细胞计数明显增加，提示肝细胞增殖能力较强。
8、肝组织中p65分子mRNA水平的变化：与Ns组相比，H2组p65分子mRNA表达水平明显降低(P<O.05)。
9、BCL.2、Cleaved PARP等凋亡相关蛋白的表达水平：与Ns组相比，H2组肝组织中Bcl.2抑凋亡蛋白表达水平上调，Cleaved PARP的表达水平降低。
10、肝组织p65、IKB Q、IKK Q、IKK 13等炎性转导分子的表达水平：与Ns组相比，H2组p65表达明显减少，而IKB Q的表达明显增加。IKK Q、IKK13的表达水平无明显变化。
结论：
l、氢生理盐水可有效减轻扩大肝切除术后的肝细胞损伤，促进肝细胞增殖;
2、氢生理盐水可以减轻缺血再灌注时氧自由基对组织的损伤;
3、氢生理盐水通过抑制NF.KB信号转导通路抑制了炎症因子的表达，减轻了肝脏组织的炎症反应;
4、氢生理盐水可有效抑制细胞凋亡。
东方肝胆外科医院从事氢气医学效应研究的课题组包括吴老、王红阳院士关于肝硬化保护，俞伟峰主任关于氢气对抗疼痛，杨广顺教授关于肝脏手术损伤保护，周伟平教授关于胆管淤积肝硬化。上述研究氢思语都先后进行了介绍。今天介绍的是杨教授课题组关于肝脏大部分切除后肝脏保护的实验研究。
杨广顺院长介绍
杨广顺，男，1952年1月出生，安徽人，1988年毕业于第二军医大学肝胆外科专业，获医学博士学位，曾于2000年赴约翰·霍普金斯大学医学院进修。现任东方肝胆外科教授，主任医师，博士生导师，胆道二科主任，兼任全军肝胆外科专业委员会主任委员、上海市普外学会副主任委员等多个学术任职。杨广顺教授擅长肝胆肿瘤的诊治和肝移植。科研主攻方向：原发性肝癌的临床诊治，原发性肝癌复发机制研究，肝移植的基础与临床研究。曾承担上海市发展基金重大课题《肝癌的标准化改善方案研究》和国家自然科学基金等4项课题，发表论文62篇，参编专著12部。先后获上海市医学科技一等奖、军队医疗成果二等奖、上海市科技进步二等奖等6项奖励。于1996年入围上海卫生系统首批“百人计划”，杨广顺2012年荣获“中国名医百强榜”上榜名医。
