斑马鱼试验：氢气有促进骨骼形成作用！

斑马鱼骨骼与人类骨骼相似，有矿化基质成分，也有功能性成骨细胞和破骨细胞。由于它们的快速发育和透明度，斑马鱼胚胎是研究器官发生，特别是骨发生的一个强有力模型，它们的骨骼结构发育迅速，受精后5天即可呈现出第一个椎骨矿化。
 

氢气已受到广泛研究，证明作为抗氧化剂具有重要的生物学和改善作用。大多数研究关注氢气的抗炎症抗氧化效应，防治多种相关疾病。Sun等发现，氢气对微重力诱导骨丢失具有保护作用，富氢水能减轻微重力模型大鼠骨密度的降低，培养基中加入氢气可以抑制微重力诱导MC3T3-E1细胞活性氧产生。有研究发现，氢气(0.06 ppm)可以改善成年斑马鱼单胞菌属感染，提高抗菌能力，调节脾脏、肝脏和肾脏抗炎基因表达。
 

本研究以骨骼发育为重点，评估氢水对斑马鱼胚胎发育的影响。实验中氢水用氢气发生器制备氢气浓度为1ppm，该浓度根据比例被用于不同的处理组(0%-100%)。5天胚胎于不同氢气浓度氢水中孵育，使用阿利新蓝8GX和紫素红S染色来染色软骨和骨骼。在光立体显微镜下进行检查胚胎，计算矿化椎体的数量来评估矿化率，为每一个胚胎记录标准化长度。
 

采用不同浓度氢水(0% ~ 100%)，每天处理斑马鱼受精卵5天，测试氢分子对胚胎活力的影响。在胚胎第5天时发现，胚胎活力从25% 氢水开始受到干扰，结果在100%氢水时胚胎死亡率达到70%(图1a)。低于15%的氢水对胚胎是安全的，不会影响活力或生长速度。半数致死剂量LD50以50%氢水计算。
 

不同浓度氢水(0% - 100%)处理受精卵5天，观察氢对胚胎成骨的影响。第5天利用与每个胚胎长度相关的矿化椎体数量对重要胚胎的矿化率进行了量化。结果发现，7%氢水的胚胎矿化水平高出299%(图1b)。图1cc显示胚胎用阿利新蓝/茜素红双染色，在轴向骨骼中发现紫色矿化椎骨。对照组胚胎平均有3块矿化椎骨，而7% 氢水处理的胚胎平均有7块。软骨发育对照组和处理鱼之间没有发现差异。
 

Carnovali M, Mariotti M, Banfi G.Molecular hydrogen enhances osteogenesis in Danio rerio embryos.J Fish Biol. 2021 Jan 6
 

氢气被认为对人体没有副作用，氢气可以通过吸入饮用等方法用于疾病改善。本研究中发现氢水对斑马鱼的毒性阈值大概在15-25%之间。氢水对鱼的危害需要考虑氢水中氧气含量下降的问题，另外鱼在氢水中生活，这不同于人饮水，相对剂量远远高于人体，25%氢水大概相当于25%氢气吸入完全饱和的剂量，这一剂量能产生毒性效应仍然需要我们关注。因为文献中没有发现氢气的毒性，本文作者猜测可能是氢气影响了氧气通过皮肤的扩散。
 

斑马鱼胚胎代表一种简单和快速的模型，因为完全透明，非常方便于探索氢水对骨骼发育的作用。研究发现，7%氢水能显著刺激斑马鱼胚胎椎骨矿化。这种效应可能和氢气抗氧化作用有关，这种作用能促进成骨细胞成骨效应。离体实验中，氢气能中和强毒性自由基保护PC12细胞氧化应激损伤。动物模型中也发现氢气对各种氧化应激损伤具有保护作用。成骨细胞受到氧化应激干扰会影响骨骼发育。这种效应可以通过ERKs和NF-kB信号通路实现。氧化应激也会影响细胞分裂，是骨骼形成的关键。研究表明，抗氧化剂能影响人类成骨细胞促进细胞分化，可促进骨骼分化和形成。本实验发现，氢气作为一种抗氧化剂对斑马鱼胚胎成骨细胞产生作用，促进椎骨成骨。7%氢水的作用和成年鱼抗感染效应的剂量类似。