吸入高浓度氢气对大鼠创伤性脑损伤的影响
王跃振, 李庭庭, 曹红玲, 等. 吸入高浓度氢气对大鼠创伤性脑损伤的影响[J]. 临床麻醉学杂志, 2019, 35(10): 1011-1015.目的 研究高浓度氢气对大鼠创伤性脑损伤的影响及其机制。
方法 雄性SD大鼠30只,体重220～240g,随机分为三组,每组10只:假手术组(S组)、脑创伤组(T组)和氢气改善组(H组)。S组暴露硬脑膜但不进行撞击,T组与H组通过液压颅脑损伤撞击建立大鼠创伤性脑损伤模型,H组于术后第1天起每天吸入1h高浓度氢气
(42%H2-21%O2-37%N2),连续7d。术后48h采用HE染色法观察脑组织病理改变，免疫组化法检测创伤周围皮质氧化应激相关蛋白MPO和HO-1含量,尼氏染色法观察尼氏小体来判断神经元状态,术后7d采用Western blot法检测凋亡相关蛋白bcl-2、bax以及caspase-3含量。
结果 与T组比较,H组神经元损伤减轻(P<0.05),异常神经细胞数量减少(P<0.05),促凋亡蛋白bax、caspase-3及氧化应激相关蛋白MPO、HO-1含量明显降低(P<0.05),抗凋亡蛋白bcl-2含量明显升高(P<0.05)。
结论 高浓度氢气可减轻大鼠创伤性脑损伤,其机制可能与氢气抗凋亡以及抗氧化应激作用相关。
氢点评：虽然是高浓度吸入，每天吸入1小时，连续7天。对于氢气这种扩散能力强大的气体，在停止吸入30分钟后，身体内大多数氢气会经过呼吸释放到体外。氢气在体内持续作用的时间比较短，从药物剂量角度看，高峰浓度比较高，但是持续药物浓度并不长。如果要更有效发挥氢气的作用，应该延长给氢气的时间或给氢气的次数。学术角度，可继续阅读后文：
创伤性脑损伤是由于外伤、撞击等因素导致的颅脑外伤。与此同时，创伤性脑损伤也是所有国家各个年龄段致死致残的主要因素，且每年造成巨大的全球经济负担。在我国，脑外伤是导致城乡居民死亡的主要因素。目前，关于改善脑外伤预后的研究正逐渐受到关注。脑创伤区周围氧化应激与凋亡反应可能与脑外伤预后较差具有相关性。氢气具有抗氧化以及抗凋亡的作用，且这种作用具有剂量相关性。已有研究报道低浓度氢气的神经保护作用，而关于高浓度氢气是否能发挥更好的神经保护作用尚未可知。为此，本研究将探索高浓度氢气对脑外伤预后的影响及其作用机制。
研究方法
动物与分组:雄性健康成年SPF级SD大鼠30只，体重220～240g，由哈尔滨医科大学实验动物学部提供[许可证号：SCXK(黑)2013⁃001]，禁食不禁饮。随机分为三组：假手术组(S组)、脑创伤组(T组)和氢气改善组(H组)，每组10只。
模型制备 大鼠液压颅脑损伤模型(FPI)是模拟脑外伤的经典模型。大鼠腹腔注射戊巴比妥钠30mg/kg，于头皮正中注射2%利多卡因浸润麻醉。固定大鼠头部于大鼠神经立体定向仪，正中切开头皮，暴露头骨，于颅骨前囟门后2mm，矢状缝左侧25mm，用磨钻磨出直径为4mm的骨孔，并确保硬脑膜完好无破损。将大鼠液压颅脑损伤仪与暴露的硬脑膜紧密的连接，以牙胶密封此连接处，成为一个密闭的腔隙。待牙胶干涸后，将大鼠液压颅脑损伤仪的摆锤固定于17°，松开摆锤固定装置，使摆锤自然下落，瞬时将液体罐内的无菌盐水冲击式作用于大鼠硬脑膜，对大鼠造成中度脑创伤，此时电脑中反馈的冲击压力在15～20atm。
脑组织形态学观察术后48h每组各取5只大鼠，深麻醉下依次行生理盐水冲洗和4%多聚甲醛灌注固定，断头取脑组织置于4%多聚甲醛中4℃固定24h，常规石蜡包埋，切片(3μm)，分别进行以下检测。(1)HE染色，取脑组织切片行脱蜡、染色、分化、复染、透明，低倍镜下(×40)取相同皮质形状的切片视为脑组织同一平面，于高倍镜下(×400)观察神经细胞损伤情况。(2)尼氏染色，切片脱蜡后在70%乙醇中6min左右，37℃孵育，取出切片在蒸馏水中洗至无乙醇为止，置入1%甲苯胺蓝染色15min，分色，镜下控制、脱水、透明、封片，低倍镜下(×40)取相同皮质形状的切片视为脑组织同一平面，于高倍镜下(×400)观察尼氏小体。
(3)免疫组化，石蜡切片与兔抗血红素加氧酶⁃1(HO⁃1)(1∶100)抗体、兔抗髓过氧化物酶(MPO)(1∶200)抗体孵育过夜。第2天孵育二抗后，室温下进行DAB反应，脱水、透明、封片，低倍镜下(×40)取相同皮质形状的切片视为脑组织同一平面，于高倍镜下(×400)观察染色情况。
Westernblot检测 术后7d每组取剩余5只大鼠，取脑损伤周围区皮质裂解，4℃下14000r/min离心20min，BCA法测定蛋白浓度。蛋白样品用10%的SDS⁃PAGE胶进行电泳分离、上样、电泳、转膜，分别以兔抗β⁃actin(1∶3000稀释液)、兔抗bcl⁃2(1∶1000稀释液)、兔抗bax(1∶2500稀释液)和兔抗caspase⁃3(1∶10000稀释液)的一抗4℃孵育过夜，次日复温后用TBS⁃T洗膜3次，用相应二抗室温孵育1h，TBS⁃T洗膜3次，加入化学发光剂后暗室曝光，得到条带。以β⁃actin为内参，用凝胶成像分析系统采集分析bcl⁃2、bax、caspase⁃3条带的积分光密度值，其与相应β⁃actin条带的积分光密度值之比作为蛋白相对含量。
改良神经功能评分 术后第1～7天，每天评估大鼠mNSS，内容包括提尾试验、置地活动试验、平衡木试验、反射及反常运动试验。记录各组大鼠四项评分总和，反映其神经功能损伤情况。
统计分析 采用SPSS21
