氢分子对氧化应激所致衰老及高密度脂蛋白结构功能损伤的保护作用研究

目的:衰老是一个复杂的过程,主要表现在生理功能的减退同时会伴随着许多慢性疾病的发生。目前存在多个衰老理论来解释这个复杂的过程,其中包括自由基/氧化应激学说,该学说认为衰老与活性氧(Reactive oxygen species,ROS)在细胞或者组织中过度积累导致的氧化损伤密切相关。基于这种衰老机制,抗氧化剂可能在治疗衰老相关疾病方面具有潜在的治疗价值。氢分子(Molecular hydrogen,H2)是无色、无味的小分子气体,许多研究认为氢分子在体内可以起到清除有害自由基,减少氧化损伤的作用。目前氢分子供体多种多样,何种氢干预方式对何种疾病效果更好,也是学界关注的一个重要问题。本课题组前期研究发现,H2可以降低氧化低密度脂蛋白和过氧化脂质水平,并改善高胆固醇血症患者的高密度脂蛋白(High density lipoprotein,HDL)功能。但H2对衰老相关的氧化应激指标和HDL功能的影响及其机制尚不明确。本研究采用D-半乳糖(D-galactose,D-gal)诱导的自由基损伤导致衰老小鼠模型,通过多种途径:4%氢气吸入(4%Hydrogen,4%H2)、饮用富氢水(H2-rich water drinking,HRW)、和腹腔注射饱和氢生理盐水(H2-rich saline injection,HRS)给予小鼠H2,测定血浆中衰老相关生物标志物和多个组织中的氧化应激水平,验证了不同氢干预方式对该衰老模型的作用效果。同时选择对氧化应激效果明显的氢干预途径--4%H2,来探究H2对HDL功能损伤的保护作用及其相关机制。方法:研究一:氢分子对D-gal诱导衰老小鼠模型衰老指标的影响6周龄雄性C57小鼠,随机分为6组(n=10/组):(i)普食对照(Con)组,(ii)D-gal模型(D-gal)组,(iii)D-gal加4%H2(D-gal+4%H2)吸入干预组,D-gal干预小鼠每天吸入4%H2,2小时。(Ⅳ)D-gal加饮用富氢水(D-gal+HRW)干预组,D-gal干预小鼠每天自由饮用富氢水。(Ⅴ)D-gal加腹腔注射富氢生理盐水(D-gal+HRS)组,D-gal干预小鼠每天给予腹腔注射富氢生理盐水(700μmol/L)剂量为0.1 m L/10g。(Ⅵ)阳性对照组D-gal加阿托伐他汀钙灌胃0.1 m L/15 mg/kg(Atorvastatin,Ator)。除对照组外,其余各组均给予D-gal皮下注射200 mg/kg体重。实验干预8周。首先,观察并记录小鼠生长状态,内眦静脉取血并用含有EDTA抗凝剂的EP管收集血液,取材,记录小鼠体重、胸腺、肝脏和脾脏重量。计算体重变化,肝脏指数、胸腺指数、脾脏指数和肝脏指数。脏器指数计算公式=脏器重量/小鼠体重。其次,应用试剂盒检测了血浆中以游离脂肪酸(Free fatty acids,FFA)为代表的血脂指标、肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)和白介素-6(Interleukin-6,IL-6)为代表的炎症指标、晚期糖基化终产物(Advanced glycation end products,AGEs)为代表的糖化指标、总抗氧化能力(Total antioxidant capacity,TAOC)为代表的氧化指标、:丙氨酸氨基转移酶(Alanine aminotransferase,ALT)为代表的肝功能指标和肌酐(Creatinine,CRE)为代表的肾脏指标。同时,我们还使用HE染色,观察了小鼠肝脏组织的形态变化。最后,使用试剂盒检测肝脏、脑、心脏组织中的丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、脂质过氧化物(Lipid peroxides,LPO)的含量和过氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)的活性,来验证氢气干预对氧化应激的影响。研究二:氢分子对D-gal小鼠HDL结构功能损伤的影响(Con组,D-gal组,D-gal+4%H2应用于该实验)1.HDL分离:将3只小鼠血浆混和成一个待检测的血浆样本,每组4个样本。应用快速蛋白质液相色谱(Fast protein liquid chromatography,FPLC)根据层析法分离出血浆中的HDL。2.HDL血脂检测:应用Bradford蛋白浓度测定试剂盒定量测定血浆中HDL的蛋白浓度。3.HDL抗氧化能力及相关酶检测:超速离心法分离小鼠血浆中的HDL,用检测生成MDA的含量来评估低密度脂蛋白(Low density lipoprotein,LDL)的氧化的程度。同时试剂盒检测血浆中脂蛋白磷脂酶A2(Lipoprotein-associated phospholipase A2,Lp-PLA2)的活性。4.HDL的脂质组学:将分离好的HDL使用液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)法进行靶向脂质组学检测。5.HDL的蛋白组学:将分离好的HDL,使用Label-free法进行蛋白组学分析。统计分析实验结果采用Graph Pad Prism6软件进行统计分析。数据用均值±标准差(Mean±SD)表示。两组组间数据比较采用t检验进行分析。多组比较采用单因素方差分析。当P<0.05时,认为具有显著差异。所有统计分析均使用SPSS 20.0进行。结果一、氢分子对D-gal诱导衰老小鼠模型衰老指标的检测结果1.基本指标结果:D-gal组小鼠的体重、肝脏指数、胸腺指数均显著下降(P<0.05),脾脏指数无明显变化。氢气干预后,三种给氢途径对体重降低没有显著改变;HRS可以显著提升肝脏指数(P<0.05);4%H2可以显著提升胸腺指数(P<0.05);HRW可以显著提升脾脏指数(P<0.05)。2.血浆脂质检测结果:D-gal组小鼠血浆FFA水平显著升高(P<0.001)。不同的给氢途径干预后均可以显著降低FFA水平(HRW组P<0.001,HRS组P<0.001,4%H2组P<0.01)。3.炎症因子检测结果:D-gal组小鼠血浆TNF-α水平显著上升(P<0.05)。不同的给氢途径干预后TNF-α水平均显著下降(HRW、HRS组P<0.001,4%H2组P<0.05)。4.糖化指标检测结果:D-gal组小鼠血浆AGEs水平显著上升(P<0.01)。不同的给氢途径干预后均可以降低AGEs水平(HRW组P<0.001,4%H2组P<0.05,HRS组P>0.05)。5.氧化指标检测结果:D-gal组小鼠血浆TAOC水平降低(P<0.01)。不同的给氢途径干预后均可以升高TAOC的水平(HRW、HRS组P<0.001,4%H2组P<0.05)。6.肝损伤标志物检测结果:D-gal组小鼠血浆中ALT活性显著上升(P<0.01),不同给氢途径均可显著降低其活性(P<0.05)。7.肾损伤标志物检测结果:D-gal组小鼠血浆中CRE水平显著上升(P<0.05),吸入4%H2可显著降低其活性(P<0.05)。8.HE染色结果:HE染色后,Con组肝细胞正常、排列规则、肝索完整。相反,D-gal组有大量炎症细胞浸润并且伴有肝细胞凋亡。不同的给氢途径治疗后均得到缓解,表现为炎症细胞浸润减少,坏死的肝细胞减少。9.肝脏组织氧化应激水平检测结果:D-gal组小鼠肝脏组织中LPO、MDA水平显著上升(P<0.001),SOD活性显著下降(P<0.001)。三种给氢途径均可以降低LPO、MDA的水平(P<0.05),提高SOD的活性(P<0.05)。10.脑组织氧化应激水平检测结果:D-gal组小鼠脑组织中LPO、MDA水平显著上升(P<0.05),SOD活性显著降低(P<0.05)。4%H2吸入可以显著降低LPO、MDA水平(P<0.05),三种给氢途径均可提高SOD活性(P<0.01)。11.心脏组织氧化应激水平检测结果:D-gal组小鼠心脏组织中LPO、MDA水平显著上升(P<0.001),SOD活性有降低趋势。4%H2吸入可以降低LPO、MDA水平(P<0.05),三种给氢途径对SOD活性没有显著影响。

二、氢分子对D-gal小鼠HDL结构功能损伤的保护作用的结果通过以上实验数据,对比三种给氢途径(4%H2,HRW,HRS)的作用效果,发现4%H2在缓解氧化应激诱导的衰老过程作用效果更为明显。因此接下来实验选择4%H2组的样本进行下一步的研究。1.4%H2干预的对衰老指标的干预结果:D-gal组小鼠血浆、肝脏和肾脏中的AGEs、血浆中的IL-6和MDA含量均显著上升(P<0.05),4%H2干预后均显著降低(P<0.05)。2.HDL抗氧化能力检测结果:D-gal组HDL的抗LDL氧化能力降低,MDA的形成增加(P<0.01)。4%H2干预后HDL抗氧化能力显著提高(P<0.05)。3.HDL相关酶检测结果:D-gal组血浆中Lp-PLA2活性增加(P<0.05),H2干预可显著降低Lp-PLA2活性(P<0.05)。4.HDL的脂质组学检测结果:HDL样本中共定量450种脂质,其中有146种脂质表现出显著的差异。与Con组相比,D-gal组有144种脂质表达显著上调(P<0.05且|FC|>1.2),主要为甘油三酯类。与D-gal组相比,D-gal+4%H2组14种脂质改变,且均显著下调(P<0.05且|FC|>1.2),主要为甘油三酯和胆固醇酯类。5.HDL的蛋白组学检测结果:HDL样本中共定量479种蛋白。与Con组相比,D-gal组有18种蛋白表达显著上调,8种蛋白表达显著下调(P<0.05且|FC|>1.2)。与D-gal组相比,D-gal+4%H2组有4种蛋白显著上调,7种蛋白显著下调(P<0.05且|FC|>1.2)。结论:1.不同给H2途径可改善D-gal诱导衰老小鼠的氧化应激。2.在不同的给H2途径中,4%H2吸入对降低部分组织的氧化应激标志物效果最明显,而其他途径在大多数指标上的效果相同。3.4%H2吸入可改变D-gal小鼠血浆HDL的脂质组成,主要为甘油三酯。4.4%H2吸入可改变D-gal小鼠血浆HDL的蛋白质组成,改善HDL的抗氧化功能。5.4%H2对氧化应激引起的衰老的缓解作用可能与改善HDL结构功能相关。6.H2治疗可能是一种很有前途的抗衰老干预措施。