分子氢与Nec-1通过抑制细胞坏死性凋亡减轻皮瓣缺血再灌注损伤的对照研究

研究目的:1.探究缺血再灌注后皮瓣中是否存在细胞坏死性凋亡现象。2.研究Nec-1(Necrostatin-1)对缺血再灌注皮瓣中的坏死性凋亡现象是否有抑制作用,另外这种抑制作用是否可以保护皮瓣,减少皮瓣缺血再灌注损伤。3.研究分子氢对于缺血再灌注皮瓣的保护作用是否是通过抑制皮瓣组织中坏死性凋亡这一途径来实现的。4.通过对于分子氢和Nec-1对于皮瓣中坏死性凋亡水平的影响作用进行比较,另外还将两者对于缺血再灌注皮瓣存活及血供情况的影响做对比,得到分子氢和Nec-1之间对于皮瓣的保护作用以及缺血再灌注皮瓣中坏死性凋亡的影响作用的差别。为今后皮瓣缺血再灌注损伤的防治研究方向提出可行的建议。研究方法:1.将雄性SD大鼠随机均分为对照组(CTL组)和Nec-1组,每组15只。在对大鼠腹部皮瓣进行缺血再灌注处理后的24h时间点,测量皮瓣存活率以及血流量;之后对不同位置皮瓣组织进行染色,观察组织和细胞的形态学变化;乃后将组织通过免疫组化及蛋白印迹试验(WB)的方式进行研究,得到两组间坏死性凋亡关键因子RIP1表达水平数据并进行对比,判断缺血再灌注皮瓣组织中是否有坏死性凋亡现象。2.根据不同组的处理方式,45只雄性SD大鼠均分为假手术组(SH组)、Nec-1组和CTL组。在皮瓣缺血再灌注后24h时间点,测量皮瓣血流情况并由此获得皮瓣存活率和血流灌注量,通过苏木精&伊红染色观察组织的炎症细胞浸润情况,而后使用TUNEL染色和电镜观察凋亡细胞数量和细胞形态,通过免疫组织化学染色对坏死性凋亡关键因子RIP1的表达水平进行检测,判断Nec-1是否可以通过抑制缺血再灌注皮瓣组织中的坏死性凋亡从而保护皮瓣组织,减少皮瓣坏死。3.成年SD雄性大鼠随机分成CTL组、SH组和经过分子氢处理的HCH组,每组15只。皮瓣缺血再灌注24h后测量皮瓣组织的存活率和血流灌注情况,并且对皮瓣组织进行形态学观察对坏死性凋亡关键因子表达水平进行检测,从而得到结果以证明分子氢对于缺血再灌注皮瓣的保护作用是通过减少其中的坏死性凋亡来达到的。4.取SD雄性大鼠60只,编号后随机均分到以下几组:SH组、HCH组、Nec-1组和CTL组。腹部皮瓣缺血再灌注24h后观察皮瓣存活率和血流灌注情况,并且对组织进行形态学观察,对坏死性凋亡关键因子表达水平进行检测。最后对比组间各项数据,以判断分子氢和Nec-1对于缺血再灌注皮瓣中的皮瓣存活率、血流灌注情况以及坏死性凋亡水平的影响是否有差别。

研究结果:1.在形态学观察方面,Nec-1组中的皮瓣组织相较于CTL组,其炎性细胞浸润情况明显为轻。在皮瓣存活率和皮瓣血供方面,Nec-1组相比CTL组有显著提高。在坏死性凋亡水平方面,随着组织与血管蒂的距离越来越远,皮瓣组织中的坏死性凋亡关键因子RIP1表达水平逐渐上升,尤其是在距离血管蒂稍远的皮瓣区域,CTL组和Nec-1组有明显差异。2.在形态学观察方面,Nec-1组中的皮瓣组织炎性细胞明显少于SH组和CTL组。在皮瓣组织存活方面,Nec-1组的皮瓣存活率和血流灌注情况虽然较SH组差,但明显优于CTL组。Nec-1组中的RIP 1表达水平则显著低于CTL组,高于SH组。3.在应用分子氢处理后,HCH组中的皮瓣组织坏死性凋亡水平明显低于CTL组,但仍高于SH组。HCH组的皮瓣存活和血流灌注情况优于CTL组,但较SH组差。4.与Nec-1相比,HCH组缺血再灌注皮瓣的存活率和血流灌注情况的影响并无显著差异。但在对于坏死性凋亡水平的影响方面,HCH组中坏死性凋亡水平较Nec-1组明显降低。研究结论:1.大鼠腹部缺血再灌注损伤皮瓣组织中存在坏死性凋亡现象;且皮瓣组织中的坏死性凋亡水平随着缺血再灌注损伤加重逐渐升高。2.Nec-1可以通过抑制RIP1作用减少大鼠腹部皮瓣缺血再灌注损伤。3.分子氢可以抑制RIP1作用从而降低大鼠腹部缺血再灌注皮瓣中坏死性凋亡的水平,减少缺血再灌注皮瓣坏死。4.分子氢与Nec-1对于缺血再灌注损伤后的皮瓣保护作用相仿,但分子氢对于坏死性凋亡的抑制作用更强。