氢气吸入通过FUNDC1自噬通路减轻脓毒症引起的肝损伤

目的:脓毒症是由病原引起的全身炎症反应综合征,其发病率及病死率逐年增高,然而,目前并没有针对脓毒症的有效治疗手段。肝脏在脓毒症的免疫与代谢等方面都发挥重要作用,然而脓毒症早期就会出现肝损伤,可以直接导致脓毒症患者病情进展或死亡,而减轻肝脏损伤的治疗手段可以降低脓毒症的发病率及病死率。线粒体是为机体提供能量的重要细胞器,线粒体损伤或功能失调参与脓毒症的发病机制。在脓毒症患者中,重要脏器的线粒体功能损伤会影响细胞能量合成,然后导致多器官衰竭。线粒体自噬（mitophagy）,作为一种特殊的选择性自噬,是调节各器官的线粒体数量以及质量的基本生理过程。FUNDC1（Fun14domain-containing protein 1）是一种近期发现的位于线粒体外膜的线粒体自噬受体,在低氧或氧化应激等条件下介导线粒体自噬的发生。氢气分子,作为一种特殊的抗氧化剂,至今为止被发现可以有效治疗70多种疾病。本课题组经过多年研究发现氢气吸入或富氢液可以有效改善脓毒症或脓毒症导致的脏器损伤,包括肝脏、肺脏、大脑以及肾脏等,然而具体的作用机制尚未研究清楚。本研究的主要目的是探讨FUNDC1介导的线粒体自噬在脓毒症引起的肝损伤中的发病机制中,以及在氢气吸入改善脓毒症小鼠肝损伤中发挥的作用。
方法:成年雄性ICR小鼠被随机分为5组:假手术组（Sham组）,脓毒症组（CLP组）,脓毒症+短肽P组（CLP+peptide P组）,脓毒症+氢气吸入组（CLP+H2组）和脓毒症+氢气吸入+短肽P组（CLP+H2+peptide P组）。CLP组小鼠采用盲肠远端结扎穿法（CLP）建立小鼠脓毒症模型,于CLP术前24h经小鼠腹腔注射FUNDC1抑制剂——短肽P（1 mg/kg）,并于术后1h吸入2%氢气3h。在氢气吸入后以及停止氢气吸入后分别检测各组小鼠动脉血及静脉血的氢气浓度;记录各组小鼠第1天至第7天的生存率;于假手术或CLP术后6h,取各组小鼠静脉血,检测小鼠血清ALT、AST浓度;取小鼠肝脏组织,观察肝组织病理学形态;Western blot法检测各组小鼠肝组织FUNDC1、p-18-FUNDC1、P62、LC3BII、caspase-1的表达水平;免疫共沉淀法检测小鼠肝组织FUNDC1与LC3BII结合水平;提取各组小鼠肝组织线粒体,检测线粒体呼吸控制率（RCR）。结果:小鼠动脉血及静脉血氢气浓度在氢气吸入后迅速上升并保持稳定水平,在氢气停止吸入后迅速下降;CLP组小鼠肝组织FUNDC1和p-18-FUNDC1的表达水平降低（P<0.05）,氢气吸入使其表达水平进一步下降（P<0.05）;免疫共沉淀结果显示,脓毒症组小鼠肝组织FUNDC1与LC3BⅡ的结合水平增加,氢气吸入进一步提高其结合水平,而短肽P可以有效降低FUNDC1与LC3BⅡ的结合水平;CLP组小鼠7天生存率明显降低（P<0.05）,氢气吸入使小鼠7天生存率显著提高（P<0.05）,然而CLP+peptide P组和CLP+H2+peptide P组小鼠7天生存率没有明显差异（P>0.05）;肝脏功能方面,CLP组小鼠肝脏出现明显病理损伤,血清ALT以及AST浓度明显增高（P<0.05）;氢气吸入减轻肝组织病理损伤程度并降低血清ALT及AST浓度（P<0.05）,然而CLP+peptide P组和CLP+H2+peptide P组无显著差异（P>0.05）;线粒体功能方面,CLP组小鼠肝组织线粒体RCR明显减低（P<0.05）,氢气吸入使RCR显著提高（P<0.05）,CLP+peptide P组和CLP+H2+peptide P组无显著差异（P>0.05）;自噬相关蛋白——P62,LC3B II,Tim23以及caspase-1的表达水平显示,CLP组小鼠肝组织线粒体自噬水平提高（P<0.05）,氢气吸入使其水平进一步升高（P<0.05）,而这些蛋白的表达水平在CLP+peptide P组和CLP+H2+peptide P组没有显著差异（P>0.05）。
结论:上述结果表明,脓毒症小鼠7天生存率显著下降,肝组织损伤明显,肝组织线粒体呼吸功能障碍。根据肝组织中FUNDC1的表达下降以及自噬相关蛋白的变化情况,表明脓毒症时FUNDC1介导的线粒体自噬水平增高。而经2%氢气吸入后可以明显提高脓毒症小鼠7天生存率,改善小鼠肝脏功能,改善脓毒症小鼠肝脏线粒体呼吸功能,同时2%氢气吸入后进一步提高FUNDC1介导的线粒体自噬水平。此外,应用FUNDC1的抑制剂——短肽P,可以有效阻断FUNDC1与LC3BⅡ的结合并降低吸入氢气后脓毒症小鼠肝组织FUNDC1介导的线粒体自噬水平,从而阻断了氢气吸入改善脓毒症小鼠肝脏损伤的作用。上述结果表明,FUNDC1介导的线粒体自噬参与脓毒症肝损伤的发病机制;2%氢气吸入可以通过提高线粒体自噬水平来改善脓毒症引起的肝脏损伤;抑制FUNDC1介导的线粒体自噬可以阻断氢气改善脓毒症肝损伤的治疗作用,说明是FUNDC1介导的线粒体自噬是氢气改善脓毒症肝损伤的可能分子机制之一。