富氢水治疗放射性口腔黏膜炎的实验研究

研究背景放射性口腔黏膜炎(Radiation Induced Oral Mucositis,RIOM)是肿瘤放疗过程中,因放射线的电离辐射引起的口腔黏膜炎性或溃疡性病变,是头颈部肿瘤放射治疗中,最常见且严重的并发症。目前被广泛接受的RIOM病理生理机制为S T.Sonis在2004年提出的五阶段理论。然而,多年来基于五阶段理论的临床治疗方案,并不能有效预防和抑制RIOM的发生和发展。这说明在此病理机制之外,还存在着其他未知的调控机制。为了深入了解RIOM的病理机制,我们使用自主设计的放射防护装置,建立了小鼠RIOM模型。在对小鼠RIOM观察研究的过程中,我们发现,即使对非放射部位进行了有效防护,放射线处理的小鼠除出现RIOM的症状之外,还出现了不明原因的腹泻症状。口腔作为消化道的起始端,口腔黏膜和胃肠道黏膜皆为全身黏膜免疫的重要组份。口腔黏膜免疫的失衡改变有可能会导致包括胃肠道黏膜免疫在内的机体黏膜免疫平衡的破坏。反之,胃肠道等口腔黏膜之外的黏膜免疫变化也会影响口腔的黏膜免疫。随着微生物组学研究技术的发展,近些年的临床和实验研究结果显示,肠道菌群可被视为黏膜免疫的重要组成部分,肠道菌群结构的变化对人类内分泌系统和免疫系统具有重要调节作用,可影响着全身多种疾病的发展和转归,然而,其是否对RIOM的发展和转归产生影响尚不清楚。富氢水(Hydrogen-rich Water,HW)是富含大量氢分子的水溶液,近些年来被认为是治疗炎症性疾病的可行策略,具有良好的临床应用前景。HW对于氧化应激异常导致的疾病有良好的治疗效果。比如:神经系统疾病、心血管疾病、运动损伤等。而氧化应激在放射性口腔黏膜炎的发病机制中也扮演了重要角色。因此,我们尝试探索富氢水对于放射性口腔黏膜炎的治疗效果。有研究表明,富氢水能通过增加肠道有益菌的丰度、改善菌群结构,促进肠道菌群微生态平衡的恢复,而肠道菌群是肠道黏膜免疫的重要组成部分。因此,本研究旨在初步探讨饮用富氢水对放射性口腔黏膜组织的保护作用,并研究这种保护作用是否与富氢水调节肠道微生物结构的能力有关。本研究内容为深入了解放射性口腔黏膜炎和肠道菌群以及胃肠道黏膜免疫的关系、探索有效的放射性口腔黏膜炎的治疗方法提供新的理论依据及思路。第一章放射性口腔黏膜炎动物模型的建立目的自主设计用于小鼠放射的固定及放射保护装置;探索构建放射性口腔黏膜炎动物模型的合适放射剂量和时间,并观察比较小鼠RIOM进展的动态变化情况。

方法1、本实验应用AutoCAD、SoildWorks、Maya以及3DMax等软件,设计小鼠放射的固定及放射保护装置。使用高精度3D打印机,选用亚光面、高质量光敏树脂材料打印小鼠放射的固定及保护装置;2、使用不同放射剂量辐射,构建小鼠放射性口腔黏膜炎模型:将12只6周龄的C57BL/6J雌性小鼠分为空白对照组、7Gy组、10Gy组、15Gy组共4组。麻醉小鼠后,取仰卧位固定于放射防护装置上,分别给予相应放射剂量以制备放射性口腔黏膜炎。于放射处理后每间隔1天,称量小鼠体重并连续观察小鼠舌体黏膜组织情况;3、标本数据收集:14天处死各组小鼠2只,获取舌体前端组织和结肠组织。获取固定组织后,进行组织病理学HE染色。结果1、在射线辐照过程中,使用自主设计、3D打印的小鼠固定及放射防护装置可以良好的固定小鼠的体位,并对非照射部位有良好的防护作用;2、放射处理后14天,7Gy组小鼠舌体黏膜组织无明显变化,10Gy组小鼠舌体黏膜组织前缘出现明显斑片状溃疡,15Gy组舌体黏膜组织前缘出现大面积的鲜红色溃疡面。3、在VRTOG评分表中,7Gy和10Gy组3期口腔黏膜炎的持续时间无明显的差异(P>0.05),而15Gy组3期口腔黏膜炎的持续时间相较于各组均有显著差异(*P<0.05);4、和空白对照组相比,15Gy辐照组中的小鼠体重出现明显波动,在放射后的前7天,两组小鼠体重无明显变化,放射后的第11-15天,15Gy辐照组组小鼠体重明显下降(*P<0.05),第15-21天,15Gy辐照组组小鼠体重逐渐恢复,与正常对照组无显著差异;5、放射后的第14天,15Gy辐照组组小鼠出现明显的舌体黏膜组织损伤。14天取材的小鼠舌体黏膜组织HE染色结果显示:15Gy辐照组组小鼠舌体黏膜出现明显溃疡症状:上皮层局部出现坏死脱落;上皮层连续性中断。在肠道组织HE染色结果显示,和空白对照组相比,15Gy辐照组组的肠道黏膜表现出明显的炎症症状,杯状细胞减少,腺体管状结构损坏,固有层可见淋巴细胞浸润;结论采用自主设计的小鼠固定及放射保护装置,可以良好的固定和保护小鼠非放射部位的组织,并充分暴露辐射部位;使用15Gy单次放射的辐照方案能够较好的模拟RIOM部分临床病理特征,为后续RIOM的治疗药物的选用与评价提供了有效工具。第二章饮用富氢水对小鼠电离辐射后口腔黏膜的保护作用目的通过已建立的小鼠RIOM模型,采用饮用富氢水的方式,研究富氢水对小鼠RIOM的影响,并初步探索放射对于小鼠基因表达的影响。
方法1、构建小鼠放射性口腔黏膜炎模型并给予富氢水饮用:将18只小鼠随机分为3组,分别为单纯辐照(RI)组、辐照后富氢水饮用(RI+HW)组和空白对照(Con)组。Con组不给予放射处理,RI组和RI+HW组采用15Gy单次放射的方案,建立放射性口腔黏膜炎模型。辐照后RI+HW组每日给予富氢水饮用,Con组和RI组于相同时间点更换等量正常饮用水。2、标本数据收集:连续检测小鼠体重变化;14天处死各组小鼠2只,获取发生RIOM小鼠舌体溃疡部位的组织和结肠组织,以及Con组小鼠舌体与之相对应部位的组织;21天时处死剩余小鼠,收集结肠、肝脏、肾脏、脾脏、心脏。各脏器使用电子秤称重,结肠行长度测量。组织固定、包埋,切片、HE染色和Masson染色。3、差异表达基因的分析:在GEO数据库中以“radiation exposure”为关键词,搜索数据集,Entry type 设定为“Series”,Organisms 设定为“Mus musculus”,Experiment type设定为“Expression profiling by array”,Attribute name设定为“tissue”筛选数据集:GSE33172中的GSM821295至GSM821301以及GSM821307至GSM821312。通过R-studio软件计算错误发现率(FDR)和表达倍数变化(foldchange)。依据FDR<0.05且| log2(fold change)|>1为筛选标准,筛选出符合标准的差异基因DEGs。利用GO分析方法和KEGG分析方法,明确DEGs富集的生物学功能及其代谢路径。结果1、RI组和RI+HW组的小鼠在接受放射后14天,均出现口腔黏膜炎症状,其中RI+HW组小鼠的黏膜炎症严重程度和累及范围明显较RI组轻。RI+HW组的小鼠体重减轻幅度也明显低于RI组(*P<0.05);此外RI+HW组小鼠相较于RI组,3期口腔黏膜炎的持续时间显著缩短(**P<0.01);2、HE染色结果显示,RI组小鼠舌体黏膜组织的上皮层剥脱;上皮下层有明显的炎症细胞浸润。Masson染色结果显示:舌体黏膜组织红色的上皮层连续性中断。HE染色和Masson染色的结果显示,在同一时间点,RI+HW组可见同样的舌体黏膜组织炎症及溃疡,但是溃疡范围及程度较RI组减小。3、RI组小鼠各脏器的重量和RI+HW组比较,无显著差异,而在结肠长度上,RI组小鼠的结肠长度显著小于RI+HW组(*P<0.05)。肠道组织HE染色结果显示,RI组小鼠肠道黏膜层上皮完整性破坏,局部炎症细胞浸润,而RI+HW组小鼠的肠道组织未见明显的异常变化。4、对数据集中Con组和RI组的差异基因进行GO富集分析,结果显示与Con组相比,RI组DEGs集中在炎症反应、免疫系统激活和细胞迁移方面;而在KEGG富集分析中,两者的肠道免疫网络IgA的生成通路出现明显差异(*P<0.05);结论富氢水能够有效降低小鼠放射性口腔黏膜炎重症(等级3)的持续时间并有效减轻放射导致的口腔黏膜组织病变。这有利于减弱放射导致的小鼠舌体黏膜组织的损伤,缓解疾病表征。此外,富氢水还能够一定程度上缓解小鼠结肠内的炎症程度。结合生物信息学分析结果,辐照可能导致肠道内黏膜免疫能力的改变。这意味着富氢水可能通过调控肠黏膜免疫,减弱RIOM的严重程度,并促进RIOM的恢复。第三章富氢水对电离辐射后小鼠肠道菌群结构的影响目的通过二代测序技术分别对RI组、RI+HW组和Con组小鼠的肠道菌群进行16S rRNA测序分析,从肠道菌群角度探讨富氢水治疗放射性口腔黏膜炎的潜在机制。方法1、小鼠粪便收集:将18只小鼠随机分为3组,处理条件同第二章。每日定时收集各组小鼠粪便,液氮速冻,置于-80℃冰箱暂存;2、肠道菌群16s rRNA测序:采用二代测序技术扩增细菌16S rRNA V3 V4区段基因,通过Illuminate Hiseq平台测序。3、使用生物信息学分析方法对Con组、RI组和RI+HW组肠道菌群进行Alpha多样性分析、Beta多样性分析和组间显著性差异分析。结果1、肠道菌群Alpha多样性分析:接受辐照的第1天,三组间的α多样性指数并无明显统计学差异。接受辐射的第13天,三组间的α多样性指数出现明显的统计学差异;2、肠道菌群Beta多样性分析:RI+HW组和RI组在辐照后的第7-9天,两组肠道菌群结构的Beta多样性出现显著差异。在辐照后第5天,RI组、RI+HW组和Con组肠道菌群结构和组成无明显差异(P=0.152)。在辐照后的第9天,三组间肠道菌群的结构和组成出现显著差异(P=0.001)。3、肠道菌群LEfSe分析:辐照后第9天,RI组和RI+HW组间共存在21种特征性物种差异;第13天,RI组和RI+HW组间共存在11种特征性物种差异。其中双歧杆菌属(Biofidobacterium)、乳杆菌属(Lactobacilus)、土杆菌属(Turicibacterales)、理研菌属(Rikenella)和芽孢杆菌纲(Bacilli)富集在RI+HW组。对部分特征性差异物种进行监测发现,多尔氏菌属(Dorea)和链球菌属(Streptococcaceae)的含量在R组中逐渐升高,而RI+HW组中则无明显变化且含量和空白对照组无显著差异。结论放射性口腔黏膜炎可导致机体黏膜免疫的改变。富氢水可通过调节肠道菌群结构,改善肠道微生物群的多样性和维持肠道微生物的稳定性,阻止辐射导致的全身性低度炎症反应的发生发展;另一方面富氢水可抑制有害菌群的增多,纠正肠道菌群的失衡,减轻由于辐射导致的黏膜免疫失调,有利于放射性口腔黏膜炎的恢复。