富氢水调控肠道菌群在化疗药所致病理性神经疼痛中的作用研究

恶性肿瘤是威胁全球健康的重大疾病,是危重病人死亡的主要原因[1]。毫无疑问,化疗作为一种重要的治疗方法,目前常用于治疗恶性肿瘤[2]。但化疗药物的使用往往会引起许多副作用,而其中,化疗药所致病理性神经痛（Chemotherapy-induced neuropathic pain,CINP）是恶性肿瘤治疗过程中最常见的合并症之一,临床上患者服用化疗药后,会出现全身或部分肢体发生持续性的自发性疼痛,间歇性灼痛,严重的痛觉过敏和超敏反应。由于其发病率高达70%,且缺乏有效的治疗手段,严重影响恶性肿瘤患者的生存质量和预后[3]。分子氢是宇宙中最丰富的元素,作为一种新型的医疗用气体分子,对70多种疾病有一定的治疗作用[4,5]。

本课题组前期研究表明,饱和富氢生理盐水处理与2%氢气吸入,对神经病理性疼痛、脓毒症及缺血再灌注损伤等多种疾病的动物及细胞模型具有良好的保护效应[4-8]。人类微生物组包括约50兆的细菌,覆盖在肠道上皮细胞的表面,与宿主的生长、发育、物质代谢等密切相关[9]。2017年有研究首次发文指出,肠道菌群是导致化疗痛的主要原因之一,化疗药应用只在无特定病原体小鼠模型中产生病理性神经痛,而对于无菌小鼠,则不产生化疗痛[10]。Toll样受体（Toll-like receptor,TLR）是一类重要的跨膜蛋白分子,参与非特异性免疫（天然免疫）,Toll样受体4分子（Toll-like receptor 4,TLR4）是人类发现的第一个Toll样受体相关蛋白,其在非特异性免疫细胞（如巨噬细胞、中性粒细胞）和T、B型淋巴细胞表面介导特异性免疫反应,可特异性识别细菌所释放的内毒素/脂多糖LPS[10],结合后可引发一系列下游事件的发生,最终导致大量炎症介质的释放。目前已发现肠道菌群可能通过LPS-TLR4途径影响化疗痛的发展。本实验拟研究富氢水对于肠道菌群的作用以及对菌群和CINP的调控机制。目的:探究LPS-TLR4通路在富氢水调控肠道菌群影响CINP中的表达情况,评价其作用。方法一:采用随机数字表发将76只雌性、6-8周龄、每只体重约为20-25g的C57BL/6J小鼠随机分为2组,每组38只:普通饮用水组（H2O组）和富氢水组（HW组）。使用高纯氢气发生器产生H2,将H2吹入饮用水中制备富氢水。H2O组喂养普通饮用水,HW组喂养富氢水,每日更换富氢水,以保证饮用水的氢分子浓度和洁净度。3周后,采集小鼠粪便进行肠道菌群16S r DNA扩增子测序多样性分析及代谢组学分析。方法二:3周的富氢水与正常饮用水喂养后,在此基础上将采用随机数字表法将实验小鼠分为将76只小鼠随机分为4组,每组19只:正常饮用水加腹腔注射生理盐水组（H2O+Saline组）、正常饮用水加腹腔注射奥沙利铂组（H2O+OXA组）、富氢水加腹腔注射生理盐水组（HW+Saline组）和富氢水加腹腔注射奥沙利铂组（HW+OXA组）。H2O组喂养普通饮用水,HW组喂养富氢水,富氢水饮用瓶中的富氢水每日更换,以保证饮用水的氢分子浓度和清洁度。奥沙利铂组给予腹腔注射奥沙利铂溶液,生理盐水组给予等体积腹腔注射生理盐水。在相应的时间内测试机械性缩足反应阈值,第20d后,收集各组小鼠粪便进行肠道菌群16S r DNA扩增子测序多样性分析。在收集小鼠粪便后测定炎症因子和氧化应激因子的含量、LPS的含量以及TLR4的水平。结果一:正常饮用水中不含氢,氢溶解度在各时间点均为0ppb。在开始制备富氢水的10min内,氢的溶解度随时间迅速增加至1200ppb。当氢溶解度不再增加后降低氢气的吹出速率,氢溶解度保持在900-1000ppb;与H2O组相比,富氢水可提高正常小鼠肠道菌群的Simpson指数,降低Shannon指数（P<0.05）;与正常水组小鼠相比,富氢水在门、科和属水平上均可改变正常小鼠肠道菌群组成的相对丰度（P<0.05）;通过LC-MS/MS筛选出了HW组与H2O组之间的17种差异代谢产物;富氢水还可影响如硫代谢途径、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢途径和赖氨酸降解途径等12种代谢途径。结果二:各组小鼠机械性痛阈值的基线没有显著差异（P>0.05）,与H2O+OXA组相比,富氢水可显著改善CINP小鼠的机械性痛觉过敏（P<0.05）;与H2O组相比,富氢水可提高CINP小鼠肠道菌群的Simpson指数,降低Shannon指数（P<0.05）,饮用相同水的小鼠群落多样性无统计学差异（P>0.05）;富氢水在门、科和属水平上均可改变CINP小鼠肠道菌群组成的相对丰度（P<0.05）。与Saline组小鼠相比,OXA组小鼠的炎症因子TNF-α、IL-6、OH-和ONOO-的表达显著增加（P<0.05）。与H2O+OXA组相比,饮用了富氢水的HW+OXA组的CINP小鼠其DRG中的TNF-α、IL-6、OH-和ONOO-的表达显著下降（P<0.05）;与Saline组小鼠相比,OXA组小鼠的LPS和TLR4的表达显著增加（P<0.05）。与H2O+OXA组相比,饮用了富氢水的HW+OXA组的CINP小鼠其血清和DRG中的LPS和TLR4的表达显著下降（P<0.05）。

结论:奥沙利铂可诱发小鼠机械性痛觉过敏,长期饮用富氢水可缓解CINP小鼠的痛觉过敏。富氢水可改变小鼠肠道菌群的多样性和结构。富氢水可能通过DRG中的LPS-TLR4通路缓解奥沙利铂调控肠道微生物所致周围神经痛。