氢气通过调控TBI后脑微血管内皮细胞PI3K/Akt/GSK3β调节自噬改善神经功能预后的机制研究

背景:创伤性脑损伤（TBI）是全世界范围内最常见的严重的公共健康问题,在中国每年有三四百万人罹患TBI,占创伤相关的死亡人数的87%,已成为年轻人的第四大主要死亡原因。此外,老年人群中TBI的发病率正在增加。氢气是一种无色无味的气体,有研究证明氢气在脑损伤和其他神经障碍疾病中具有保护性作用,但是具体的作用机制尚不清楚。自噬指的是真核细胞通过溶酶体降解来消除细胞质物质的一组古老的进化机制,而自噬的失调是TBI后神经元细胞死亡的原因之一。有研究证明芦丁通过激活PI3K/AKT/GSK3β通路,清除自由基的生成及抗炎作用,从而提供对γ射线诱导的脑损伤的保护作用,因此,本课题假设:氢气通过激活PI3K/Akt/GSK3β信号通路调控对自噬的抑制,发挥对颅脑外伤的保护作用。本研究拟采用Bend.3细胞划痕模型,通过检测细胞形态及生长速度、信号通路蛋白p-Akt和p-GSK3β、自噬相关蛋白LC3-II/I、Beclin-1和p62的表达水平,从自噬的角度阐明氢气治疗颅脑外伤的具体机制,进一步探讨PI3K/Akt/GSK3β信号通路在此过程中的作用,明确氢气通过激活PI3K/Akt/GSK3β信号通路而抑制自噬,从而改善颅脑外伤,为氢气治疗颅脑外伤提供科学依据。目的:观察氢气对划痕后的Bend.3细胞的生长速度及细胞形态的影响,并检测氢气对TBI后的信号通路蛋白p-Akt和p-GSK3β、自噬相关蛋白LC3-II/I、Beclin-1和p62的表达水平的影响。
方法:培养Bend.3细胞,将细胞随机分为对照组、对照+氢气组、TBI组、TBI+氢气组（TBI+H2组）,TBI+氢气+PI3K抑制组（TBI+H2+LY组）,TBI+氢气+自噬激活组（TBI+H2+Rap组）和TBI+氢气+自噬抑制组（TBI+H2+CQ组）。每组十孔,建模后,将对照+H2组、TBI+H2组、TBI+H2+LY组、TBI+H2+Rap组和TBI+H2+CQ组中的细胞用富氢培养基孵育。在氢干预的同一时期,分别用PI3K抑制剂Ly294002（20u M）和自噬诱导剂雷帕霉素（20u M）以及自噬抑制剂氯奎（10u M）处理TBI+H2+LY组、TBI+Rap组和TBI+H2+CQ组的细胞24小时。处理后24小时,观察细胞的生长状态,并用MTT法测定细胞的增殖活性,采用免疫荧光方式观察各组LC3活性,提取细胞蛋白,用Western Blot法测定p-Akt、p-GSK3β、Beclin-1、LC3-II/I及p62的表达水平。结果:培养4天后,b End.3细胞开始融合、成熟,然后进行划痕实验,在抓挠0小时后可见创面,划痕24小时后创面明显缩小。氢处理24小时后,细胞几乎可以重新融合并重新内皮化。但是,PI3K抑制剂Ly294002和自噬诱导剂雷帕霉素可以逆转氢气的保护作用,经Ly294002或雷帕霉素处理后,细胞的再融合率明显降低。而氯奎可以提高细胞的再融合率。Sham组与Sham+H2组的信号通路蛋白p-Akt和p-GSK3β、自噬相关蛋白LC3-II/I和Beclin-1的表达水平差异没有统计学意义（P>0.05）,但与Sham组比较,TBI组的p-Akt和p-GSK3β、LC3-II/I和Beclin-1的表达水平增强（P<0.05）,氢气治疗上调了TBI中p-Akt和p-GSK3β的表达水平并抑制了TBI中LC3-II/I和Beclin-1的表达,但是p62的表达水平在各组中差异没有统计学意义（P>0.05）;与TBI+H2组比较,TBI+H2+LY组的b End.3细胞的存活率、p-Akt和p-GSK3β、p62的表达水平下降（P<0.05）,LC3-II/I和Beclin-1的表达水平增强（P<0.05）,而TBI+H2+Rap组的细胞存活率下降,LC3-II/I和Beclin-1的表达水平增强（P<0.05）,但p62的表达水平下降（P<0.05）,而TBI+H2+CQ组的细胞存活率及p62的表达水平增强（P<0.05）;但p-Akt和p-GSK3β的表达水平在三组中差异没有统计学意义（P>0.05）。

结论:氢气通过激活PI3K/Akt/GSK3β信号通路介导自噬的抑制,从而改善颅脑外伤。