氢气治疗创伤性脑损伤的研究

作者来自无锡904医院

Hu Y, Feng X, Chen J, Wu Y, Shen L. Hydrogen-rich saline alleviates early brain injury through inhibition of necroptosis and neuroinflammation via the ROS/HO-1 signaling pathway after traumatic brain injury. Exp Ther Med. 2022 Feb;23(2):126.

创伤性脑损伤(Traumatic brain injury, TBI)已被公认为是一个严重的公共卫生问题，是导致残疾和死亡的关键因素，在世界范围内具有巨大的经济负担。TBI高发(中国在1983年至1985年间为1/ 1000)主要发生在中低收入国家以及发展中国家，包括中国和伊朗。由于机动车碰撞等交通事故的大量增加，TBI的患病率呈现快速增长的趋势。尽管近年来有越来越多的随机对照试验包括颅内压监测、治疗性低温、手术方法和药物给药，但长期结果并没有显著改善，尤其是在药物干预后。因此，进一步阐明创伤性脑损伤的生理病理过程，并确定治疗创伤性脑损伤的新的有效药理靶点是十分重要的。众所周知，TBI的病理生理包括多种病理生理变化，主要包括颅脑原发损伤和继发性脑损伤，导致TBI后神经元死亡、神经功能缺损和死亡。颅脑原发损伤是对脑组织的直接物理损伤，难以预防，通常无法逆转，导致脑组织组织紊乱，脑出血及血脑屏障(BBB)损伤。继发性脑损伤包括钙超载、氧化应激、神经炎症、自噬、脂质过氧化、凋亡和坏死，且可逆转。

最近发现，坏死是调控坏死的途径之一，也是caspase非依赖性程序性细胞死亡的机制之一，需要蛋白混合谱系激酶样结构域(MLKL)和受体相互作用蛋白激酶3 (RIP3)，并由死亡受体触发。越来越多的证据表明，坏死在中枢神经系统疾病，如TBI、脑出血、缺血性中风、阿尔茨海默病、帕金森病和肌萎缩性侧索硬化症中起着重要的作用。TNF配体家族成员的激活，如RIP1和MLKL，是诱导坏死所必需的最上游信号活性。RIP1的激活通过诱导RIP1- rip3 - mlkl复合体参与坏死。早期脑损伤(EBI)中常见的坏死可能是脑损伤发生的机制之一。

近年来，富氢盐水或氢气通过调节神经元凋亡、炎症反应和氧化应激等作用，对人体多种疾病如神经退行性疾病、自发性蛛网膜下腔出血、脑卒中和缺血-再灌注损伤等具有保护作用。先前的一项研究表明，氢可以选择性地减少过亚硝酸盐和羟基自由基，因此具有保护细胞、抗炎、抗凋亡和抗氧化的重要功能。然而，富氢生理盐水治疗脑外伤的神经保护作用仍存在争议。血红素加氧酶-1 (HO-1)是细胞防御系统的重要元素，被氧化刺激的损伤激活并对其起作用。在中枢神经系统(CNS)中，HO-1发挥抗坏死、抗神经炎症和神经保护功能。在我们之前的研究中，HO-1被证明可以调节急性CNS疾病中的神经元死亡。因此，针对HO-1的治疗可能对预防TBI后的坏死、氧化应激和炎症有潜在的作用。尽管如此，关于富氢盐水治疗的潜在神经保护益处的具体机制尚不清楚。本研究探讨了富氢生理盐水对TBI小鼠模型的神经保护作用是否通过影响神经炎症和坏死发生，以及神经保护是否依赖于活性氧(ROS)/HO-1通路。

创伤性脑损伤动物模型

建立TBI模型时严格遵循局灶性损伤的Feeney减肥模型(33,34)。简单地说，用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉小鼠。随后，小鼠被置于脑立体定向装置中。操作时，使用加热垫确保直肠温度保持在37±0.5˚C。在左半球钻孔时的坐标设置为:布雷格玛水平面后0.2 mm，外侧1 mm，腹侧2.2 mm。为了观察硬脑膜，取下骨膜。硬脑膜随后被放置在包括一个冲击传感器踏板的失重设备下;安徽正华生物仪器设备有限公司将直径3mm、重量240g的金属通过导管从硬脑膜上方1cm处置于硬脑膜上。随后闭合头皮，将小鼠从立体定向器中取出。随后，用医用骨蜡将洞盖住。假组的动物接受了类似的手术治疗，但没有进行减肥手术。TBI后72 h腹腔注射戊巴比妥钠100 mg/kg。处死小鼠后采集脑组织样本。新鲜标本(大脑皮层)和血清在液氮(-196˚C)中保存，海马在4%福尔马林固定(4˚C)中保存≥48 h。

药物制备和给药

TBI模型建立成功后，小鼠每天腹腔注射含纯生理盐水(对照)或富氢盐水(5 ml/kg;实验)。按照既往研究(35,36)的方法制备富氢生理盐水。简单地说，纯化的氢气在0.4 MPa的高压下溶于生理盐水中2 h。生理浓度维持在1.73 ml / 100 ml生理盐水(平均>6 mmol/l)。富氢盐水常压保存在4˚C无死体积的铝袋中。每周合成新鲜富氢盐水，保证浓度一致。在之前的研究中用气相色谱法评价和检测盐水中的氢含量(37)。

神经行为评估

采用先前发表的神经系统分级系统(38,39)，通过测定神经功能来评估脑损伤72小时后的脑损伤程度。评分系统包括反射、感觉、平衡和运动测试。神经系统评分范围为0 ~ 18分，通过个人评分相加计算(表SI)。对每个队列的所有小鼠进行行为评估，评分越高表明神经功能受损。

富氢生理盐水可缓解脑外伤后的神经功能缺损和脑水肿

采用改良的神经系统严重程度评分法评估神经系统损伤情况，了解富氢生理盐水对脑外伤后的神经保护作用。采用干湿法测定脑损伤72h后的脑水含量，评价脑损伤程度。研究结果表明，TBI与脑水含量的显著增加有关，富氢盐水处理后脑水含量有所缓解(图1B)。神经系统评分的对比结果显示，富氢生理盐水处理组的神经系统评分明显高于创伤性脑损伤组，且富氢生理盐水处理显著改善了神经系统功能(图1A)。